一種適用于羔羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種適用于黑羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 幼畜體外胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)（juvenileinvitroemb;ryotransfer,JIVET)是 集成了幼齡母畜超數(shù)排卵技術(shù)、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)、體外受精技術(shù)、胚胎體外培養(yǎng)技術(shù) 和胚胎移植技術(shù)等一系列繁殖技術(shù)為一體的生物技術(shù)體系。JIVET技術(shù)將幼齡母畜卵巢上 大量的卵母細(xì)胞為卵源在體外培養(yǎng)生產(chǎn)胚胎，有利于縮短家畜繁殖的世代間隔，充分發(fā)掘 優(yōu)良遺傳性狀母畜的繁殖潛能，提高畜群的遺傳改良速度與生產(chǎn)效率，為家畜育種提供豐 富的遺傳資源。
[0003] 體外受精是指獲能精子與成熟卵母細(xì)胞在體外完成受精的過(guò)程，其環(huán)境對(duì)受精率 影響很大。受精環(huán)境除了溫度、濕度、抑值和空氣成分，還有受精培養(yǎng)基。近年來(lái)，很多試 驗(yàn)采用S0F、TALP、Hepes-M199W及B0等培養(yǎng)基作為體外受精培養(yǎng)基。不同的受精液，其受 精的培養(yǎng)時(shí)間也不同。B0培養(yǎng)基一般需培養(yǎng)6~化，而TALP培養(yǎng)基或者S0F培養(yǎng)基需要 培養(yǎng)18~2地。精卵培養(yǎng)時(shí)間不足，會(huì)降低受精率；而精卵解育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，精子在代謝過(guò)程 中產(chǎn)生并積累的大量有害物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞及受精卵的正常生理過(guò)程，阻礙其正常 受精和卵裂。同時(shí)精卵在解育過(guò)程中，精子將消耗培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使卵母細(xì)胞及受精 卵處于一個(gè)營(yíng)養(yǎng)不足的培養(yǎng)環(huán)境中，極大降低了受精率和胚胎后期發(fā)育質(zhì)量；適當(dāng)?shù)氖芫?時(shí)間將提高受精率及胚胎發(fā)育潛能。體外受精一般采用液滴培養(yǎng)法，其中精子的密度一般 控制在2~10X1〇6個(gè)/mL，精子密度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致受精效果下降，而精子密度過(guò)高則會(huì)出 現(xiàn)多精入卵的現(xiàn)象。因而，提高家畜卵母細(xì)胞的受精率要從多重條件進(jìn)行優(yōu)化處理。
[0004] 本研究根據(jù)已有報(bào)道W及對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外受精的反復(fù)試驗(yàn)，W期總結(jié)出一套 簡(jiǎn)單易行的黑羊卵母細(xì)胞體外受精方案，完善黑羊卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)，提高黑羊卵母 細(xì)胞的受精效果，為后續(xù)源于黑羊受精卵的胚胎發(fā)育方面的研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)〇化]本發(fā)明的目的是建立一種適用于黑羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法。
[0006] W江蘇地方白山羊品種為動(dòng)物模型，分別從成年母羊和黑羊卵巢中采集卵丘卵母 細(xì)胞復(fù)合體（COCs)進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。收集成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，對(duì)黑羊W及成 年母羊卵母細(xì)胞體外受精卵裂率進(jìn)行對(duì)比研究，W期建立一種簡(jiǎn)單、適用的黑羊卵母細(xì)胞 體外受精的方法。
[0007] 本發(fā)明所述的適用于黑羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法，包括卵母細(xì)胞獲取及成 熟培養(yǎng)、精子獲能，成熟卵母細(xì)胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的步驟；其中精子獲能時(shí)將裝有精 子的小管放入培養(yǎng)箱中傾斜45°上游法解育40~50min后，吸取上層含高活力精子的精液 到滅菌PCR小管中，加入洗涂液2000rpm、3min離屯、洗涂2次；成熟卵母細(xì)胞體外受精時(shí)在 培養(yǎng)箱中解育8~化。
[0008] 上述步驟中的解育時(shí)間、離屯、機(jī)的轉(zhuǎn)速及離屯、時(shí)間、離屯、洗涂次數(shù)、成熟卵母細(xì)胞 的培養(yǎng)時(shí)間等的組合利用，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)效果有實(shí)質(zhì)性影響。
[0009] 由表1可知，在所建立的培養(yǎng)技術(shù)體系下，黑羊和成年母羊受精卵的卵裂率分別 為33. 04 + 3. 57和34. 85 +1. 83,與目前相關(guān)研究報(bào)道中山羊受精卵卵裂率的水平基本一 致。同時(shí)，黑羊和成年母羊受精卵的卵裂率無(wú)顯著性差異。說(shuō)明，本研究所建立的黑羊卵母 細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法有效可行。
[0010] 表1黑羊和成年母羊體外受精卵裂率的比較
[0011]
[0012] 注：上標(biāo)有相同字母表示差異不顯著任〉0.05)，無(wú)相同字母表示差異顯著 (P<0. 05)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是2-細(xì)胞胚胎電鏡下，400X。A為成年母羊胚胎巧為黑羊胚胎。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 1.試驗(yàn)材料
[0015] 選擇江蘇地方白山羊品種，分別為健康的1~2歲成年母羊和1~2月齡黑羊，摘 取其新鮮的卵巢。
[0016] B0 液、洗涂液：稱(chēng)取NaCl655.Omg，化肥0331 0 . 4mg，葡萄糖 251. 8mg，KC1 30.Omg， CaClzie. 7mg，NaH2P〇4ll. 5mg，MgCl2l〇. 6mg，丙酬酸鋼 5. 5mg，1%酪紅 4. 00ml，lOOIU/ml青霉 素，lOOIU/ml鏈霉素，加超純水至100ml定容，0. 22μm濾器過(guò)濾除菌分裝備用。
[0017] B0獲能液、B0受精液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：B0液，肝素鋼20μg/血，BSAlOmg/血混合后 過(guò)濾0. 22μm濾器除菌，38. 5°CC〇2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡30分鐘。
[0018] 受精卵培養(yǎng)液：TCM199,FBS20 %，Na肥032. 2mg/mL，丙酬酸鋼 25.Omg/mL，肥陽(yáng)S 6.Omg/mU青霉素鋼和硫酸鏈霉素各lOOIU/ml。，
[0019] 2.卵母細(xì)胞的采集
[0020] 卵巢運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，用手術(shù)剪刀快速去除其表面多余組織，用38. 5°C的卵巢洗涂 液清洗3次后放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中。把培養(yǎng)皿放置在39Γ的溫控板上，挑選表面直徑 為1~5mm的卵泡，用無(wú)菌綴子固定住住卵巢，用手術(shù)刀輕輕劃破卵泡，再用注射器吸取PBS 沖洗劃破的卵泡，匯集沖洗液，靜置Imin后在體視顯微鏡下檢卵，用口吸管挑選出形態(tài)正 常、胞質(zhì)均勻且包有1層W上完整卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs)
[0021] 3.卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)
[0022] 成熟培養(yǎng)采用微滴培養(yǎng)法，微滴上覆蓋石蠟油。本試驗(yàn)選用35mm直徑的培養(yǎng)皿， 可W放置4個(gè)微滴，每個(gè)微滴50μ1成熟液。把挑選好的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體用口吸管 移入平衡化之后的微滴中洗涂Ξ次，放置在最后一個(gè)微滴中。最后把培養(yǎng)皿移入38. 5°C， 5%C〇2,飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~26h，黑羊則為22~24h。培養(yǎng)結(jié)果時(shí)先通過(guò)觀 察卵丘顆粒細(xì)胞的擴(kuò)散狀況來(lái)初步判斷卵母細(xì)胞整體成熟效果是否良好，然后把卵丘-卵 母細(xì)胞復(fù)合體放入透明質(zhì)酸酶溶液微滴里，用槍頭快速吹打W剝離顆粒細(xì)胞，收集卵母細(xì) 胞裸卵在倒置顯微鏡下觀察是否成熟，W細(xì)胞分出第一極體為成熟標(biāo)準(zhǔn)。
[0023] 3.精子的獲能處理
[0024] 采集本品種種公羊新鮮精液。公羊平均每次精液量1.OmU精子密度1~3X109個(gè) /ml,抑值6. 9,活力0. 8W上，符合常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。種公羊新鮮精液，用4層滅菌紗布過(guò)濾后，用 微量移液槍吸取約0. 2ml置于含有1~1. 5ml精子洗涂液的滅菌PCR小管底部。將試管放 入培養(yǎng)箱中傾斜45°上游法解育30~60min后，吸取上層含高活力精子的精液到滅菌PCR 小管中，加入洗涂液離屯、洗涂2次（200化pm，3~5min)，棄去上清液。用平衡化W上的B0 獲能液溶解沉淀，置于38. 5°C、5%C〇2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中解育1~化備用。 陽(yáng)0巧]4.卵母細(xì)胞體外受精
[00%] 將成熟的卵母細(xì)胞移入平衡化W上的BO受精液微滴里，每個(gè)微滴內(nèi)放10個(gè)卵母 細(xì)胞，然后加入10μ1用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)過(guò)密度的體外獲能精液，精子最終密度為2~ 10Χ106個(gè)/mU加蓋后置于5%C0 2、38. 5°C、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中解育7~化。
[0027] 5.受精卵的體外培養(yǎng)
[0028] 在受精7~化后，使用口吸管吹打除去卵母細(xì)胞外面的精子和卵丘細(xì)胞，把受精 后的卵母細(xì)胞移入平衡過(guò)的受精卵培養(yǎng)液液中，置于38. 5°C、5%C〇2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，每隔2d半量更換胚胎培養(yǎng)液。在受精后4化檢查受精卵的卵裂率（見(jiàn)圖1)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適用于羔羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法，包括卵母細(xì)胞獲取及成熟培養(yǎng)、精 子獲能，成熟卵母細(xì)胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的步驟，其特征在于，精子獲能時(shí)將裝有精子 的小管放入培養(yǎng)箱中傾斜45°上游法孵育40~50min后，吸取上層含高活力精子的精液到 滅菌PCR小管中，加入洗滌液2000rpm、3min離心洗滌2次；成熟卵母細(xì)胞體外受精時(shí)在培 養(yǎng)箱中孵育8~9h。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于羔羊卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)的方法。該方法包括卵母細(xì)胞獲取及成熟培養(yǎng)、精子獲能，成熟卵母細(xì)胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的步驟；在精子獲能和成熟卵母細(xì)胞體外受精步驟中對(duì)孵育時(shí)間、離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間、離心洗滌次數(shù)、成熟卵母細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間條件進(jìn)行優(yōu)化組合利用，實(shí)現(xiàn)了羔羊和成年母羊受精卵的卵裂率基本一致。
【IPC分類(lèi)】C12N5/073, C12N5/076, C12N5/075
【公開(kāi)號(hào)】CN105255820
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510862744
【發(fā)明人】李擁軍, 蔡繆熒, 程國(guó)虎, 張昊, 郭海燕
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日