一種纖維素酶高效生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種纖維素酶生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶來(lái)源廣泛、成分復(fù)雜，廣泛存在于昆蟲(chóng)體、軟體動(dòng)物體W及真菌、細(xì)菌與 放線菌等微生物的代謝產(chǎn)物中，主要生產(chǎn)途徑是微生物發(fā)酵，其中W絲狀真菌和細(xì)菌纖維 素酶應(yīng)用最為廣泛，目前主要還是利用真菌來(lái)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。
[0003] 在細(xì)菌中大多數(shù)好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌都富含豐富的纖維素酶系，特別是瘤胃中富 含多種纖維素降解酶系的厭氧菌。世界纖維素市場(chǎng)中的纖維素酶有20 %來(lái)自木霉屬和曲 霉屬。主要是由于絲狀真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的分 離和提?。虎诋a(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理；③同時(shí)可產(chǎn)生許多半纖 維素酶、果膠酶、淀粉酶等。纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶系，酶系由Ξ類(lèi)功能不同但又互補(bǔ)的酶 組成。運(yùn)Ξ類(lèi)酶分別是內(nèi)切葡聚糖酶巧G，Cx酶，又稱(chēng)CMC酶）、外切葡聚糖酶（纖維二糖 水解酶，CBH，C1酶）和β-葡萄糖巧酶度化，纖維二糖酶）；大多數(shù)編碼纖維素酶的基因是 染色體基因。纖維素酶系降解原理目前尚無(wú)定論，主要有Ξ種作用機(jī)理：協(xié)同理論、碎片假 說(shuō)和原初反應(yīng)假說(shuō)，其中W協(xié)同理論被大部分研究學(xué)者和專(zhuān)家所認(rèn)可，其主要觀點(diǎn)為內(nèi)切 葡聚糖運(yùn)類(lèi)酶首先作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)識(shí)別并水解β-1，4-糖巧鍵， 將長(zhǎng)鏈纖維素分子截?cái)?，產(chǎn)生大量非還原性末端。然后外切葡聚糖酶逐個(gè)切下纖維素的非 還原末端水解產(chǎn)生纖維二糖；而β-葡萄糖巧酶則水解纖維二糖生成葡萄糖。Ξ者缺一不 可，協(xié)同作用，也只有在合適的比例和組成下，才能共同作用快速實(shí)現(xiàn)纖維素的完全水解。
[0004] 纖維素酶發(fā)酵過(guò)程容易受到碳水阻遏效應(yīng)（CCR)對(duì)酶發(fā)酵合成的影響，即在半纖 維素和/或纖維素酶合成過(guò)程中，往往由于培養(yǎng)基中存在著葡萄糖、木糖等單糖而通過(guò)碳 水阻遏效應(yīng)（CCR)抑制了酶的合成。目前常用選育方法消除部分CCR效應(yīng)，例如，周廣麟等 人先后研究了去泛素化蛋白酶基因creB缺失及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因bglR缺失對(duì)生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)狀 態(tài)及形態(tài)、纖維素酶活力、纖維素酶性質(zhì)的影響。creB基因缺失突變株纖維素酶表達(dá)分泌抗 葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)，菌株的濾紙酶活、內(nèi)切纖維素酶活、木聚糖酶活W及外切纖維素酶活 分別提高1. 8倍、1. 71倍、2. 06倍化及2. 04倍，其胞外蛋白質(zhì)含量提高了 2. 68倍；而bglR 基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄調(diào)控因子的缺失，β葡萄糖巧酶酶活力得到大幅度提高，提高了 40%，但濾紙 酶活、內(nèi)切葡聚糖酶及木聚糖酶活明顯降低?，F(xiàn)有技術(shù)雖然取得了一定成效，但如何解決纖 維素酶發(fā)酵過(guò)程碳水阻遏效應(yīng)（CCR)、提高纖維素生產(chǎn)能力，仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的主 要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，草酸青霉發(fā)酵生產(chǎn)纖 維素酶的過(guò)程中，補(bǔ)料、DO、抑等發(fā)酵條件與纖維素酶表達(dá)量密切相關(guān)，通過(guò)補(bǔ)料、DO、抑等 工藝實(shí)現(xiàn)了纖維素的表達(dá)量和胞外蛋白的表達(dá)量的大幅度增加；進(jìn)一步的，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)， 補(bǔ)料過(guò)程中，菌株的代謝與攝氧率極為相關(guān)，通過(guò)OUR控制可W解除補(bǔ)料過(guò)程的碳阻遏效 應(yīng)，控制0UR維持在一定水平維持菌株正常生長(zhǎng)代謝來(lái)增強(qiáng)次級(jí)產(chǎn)物纖維素酶的產(chǎn)生，可 W明顯提高生產(chǎn)纖維素酶的FPA、β葡萄糖巧酶活力和蛋白含量。
[0006] 具體的，本發(fā)明提供了W下技術(shù)方案：
[0007] -種草酸青霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，控制整個(gè)發(fā)酵期間抑 維持在3. 5~6. 0之間，發(fā)酵中后期至發(fā)酵結(jié)束期間進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，期間控制攝氧率（0UR) 維持 12(±5)~35(±5)mmol/L/h。
[0008] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了草酸青霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶中進(jìn)入發(fā)酵中后期的時(shí)間， 此時(shí)葡萄糖消耗，碳阻遏效應(yīng)解除，纖維素酶開(kāi)始合成，優(yōu)選，發(fā)酵24h至發(fā)酵結(jié)束期間進(jìn) 行補(bǔ)料培養(yǎng)。
[0009] 優(yōu)選的，補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，0UR與溶氧、補(bǔ)料Ξ者變量關(guān)系，溶氧與補(bǔ)料呈協(xié)同互 補(bǔ)關(guān)系，0UR與溶氧具有一定的比例關(guān)系，通過(guò)更換獎(jiǎng)葉，調(diào)節(jié)攬拌轉(zhuǎn)速保持溶氧在15%W 上。
[0010] 優(yōu)選的，補(bǔ)料培養(yǎng)期間控制攝氧率（0UR)維持15(±5)~30(±5)mmol/L/h。
[0011] 優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程抑調(diào)節(jié)為：發(fā)酵開(kāi)始抑調(diào)整為5. 5-6.0,0-20h抑逐漸下降， 用氨水控制發(fā)酵培養(yǎng)基抑3. 5W上，50-6化后抑回升至5. 5-6. 0后，開(kāi)始用憐酸調(diào)節(jié)抑至 6. 0W下；
[0012] 優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行通氣量控制，每分鐘通氣量：發(fā)酵體積> 1:1 ;
[0013] 優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程調(diào)節(jié)溶氧，發(fā)酵起始溶氧調(diào)整至100%，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攬 拌轉(zhuǎn)速保持溶氧在15 %W上；
[0014] 優(yōu)選的，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程溫度保持28~33°C;
[0015] 更為優(yōu)選的，將草酸青霉劃線接種于教皮培養(yǎng)基中28~32°C培養(yǎng)3-5天，待長(zhǎng)出 粉紅色的抱子后轉(zhuǎn)接至新鮮教皮培養(yǎng)基培養(yǎng)3天作為菌種。接0. 2-20cm2菌種接種于種子 培養(yǎng)基中，28~32°C20化pm發(fā)酵24~4她，制備成一級(jí)種子，按照5%~10%的接種量接 種一級(jí)種子于種子培養(yǎng)基中，28~32°C20化pm培養(yǎng)30~4化制成二級(jí)種子，然后將二級(jí) 種子接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵。產(chǎn)酶發(fā)酵具體參數(shù)控制如下：
[0016] (1)抑調(diào)節(jié)：發(fā)酵開(kāi)始抑調(diào)整為5.5-6.0,0-20h抑逐漸下降，用氨水控制發(fā)酵 培養(yǎng)基抑3. 5W上，50-6化后抑回升至5. 5-6. 0后，開(kāi)始用憐酸調(diào)節(jié)抑至6. 0W下；
[0017] (2)通氣量控制：每分鐘通氣量：發(fā)酵體積> 1:1 ;
[0018] (3)溶氧調(diào)節(jié)：發(fā)酵起始溶氧調(diào)整至100%，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攬拌轉(zhuǎn)速保持溶 氧在15%W上；
[0019] (4)溫度調(diào)控：整個(gè)發(fā)酵過(guò)程溫度保持28~33°C;
[0020] (5)OUR調(diào)節(jié)：
[0021] 發(fā)酵開(kāi)始，OUR隨菌體濃度增加而逐漸升高，在該培養(yǎng)基條件下，在4化左右達(dá)到 最高值，約23-27mmol/L/h，維持約10~1化后，隨著培養(yǎng)基中碳源和氮源的耗盡，發(fā)酵開(kāi) 始出現(xiàn)碳氮源限制，反應(yīng)速率開(kāi)始下降，0UR開(kāi)始降低，在0UR出現(xiàn)明顯下降后，約在下降 地（發(fā)酵時(shí)間約5化左右），開(kāi)始補(bǔ)加葡萄糖、木糖或微晶纖維素，控制0UR至15( + 5)-30(±5)mmol/L/h之間維持10化，出現(xiàn)最高纖維素酶濾紙活力，胞外蛋白含量最大，此時(shí)停 止發(fā)酵。
[0022] 培養(yǎng)過(guò)程所用的培養(yǎng)基如下：
[0023] 教皮培養(yǎng)基：7~10%教皮與適量的自來(lái)水中，煮沸30min，8層紗布過(guò)濾，再用自 來(lái)水定容到所需要的體積，加入1. 5%的瓊脂，配置成教皮斜面培養(yǎng)基，用于菌種活化與篩 選。
[0024] 種子培養(yǎng)基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸錠，0. 3%憐 酸二氨鐘，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rC滅菌20min。
[00巧]產(chǎn)酶培養(yǎng)基：2~7 %木糖渣，1~4%教皮，0. 2~1 %微晶纖維素，0. 5 %豆餅 粉，0. 2 %硫酸錠，0. 1 %尿素，0. 3 %憐酸二氨鐘，0. 05 %硫酸儀，0. 3 %吐溫80,121°C滅菌 30min〇
[0026] 采用質(zhì)譜儀或尾氣分析儀對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)在線采集分析，該 質(zhì)譜儀能夠精確測(cè)定發(fā)酵過(guò)程尾氣中的氨氣、氮?dú)狻⒍趸己脱鯕獾确肿恿?00W內(nèi)的 可揮發(fā)性氣體。使用之前用標(biāo)準(zhǔn)氣體對(duì)儀器的響應(yīng)度進(jìn)行標(biāo)定。
[0027] 攝氧率伽R)測(cè)定：
[0028] 0UR的計(jì)算通過(guò)對(duì)發(fā)酵尾氣的分析數(shù)據(jù)計(jì)算得到。W進(jìn)氣和尾氣中惰性氣體肥維 持恒定建立平衡方程，求得0UR的計(jì)算公式如下：
[OOWFm:進(jìn)氣流量L/min;V:發(fā)酵液體積L;C*in\C02m\CC02m:分別為進(jìn)氣中惰性氣 體、氧氣及二氧化碳的質(zhì)量分率；C02wt\CC02。。,:分別為排氣中氧氣和二氧化碳的質(zhì)量分率；Pm:進(jìn)氣的絕對(duì)壓強(qiáng)化；t1。:進(jìn)氣的溫度°C;h:進(jìn)氣的相對(duì)濕度（％ )。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，
[0033] (1)通過(guò)維持菌株的最佳0UR值來(lái)實(shí)現(xiàn)菌株生長(zhǎng)最佳的碳氮比，防止菌體在發(fā)酵 過(guò)程中出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)饑餓現(xiàn)象而導(dǎo)致自隧現(xiàn)象，而導(dǎo)致蛋白含量偏低，酶活力不高的現(xiàn)象。
[0034] (2)通過(guò)0UR來(lái)控制菌體整個(gè)生理狀態(tài)與生長(zhǎng)狀態(tài)，形成了菌體生長(zhǎng)、纖維素酶產(chǎn) 生和大規(guī)模生產(chǎn)的核屯、控制因素，可W數(shù)十倍放大、準(zhǔn)確控制大規(guī)模發(fā)酵。
[0035] (3)通過(guò)0UR來(lái)反應(yīng)菌體生長(zhǎng)需求，部分解除碳阻遏效應(yīng)，大幅度提高酶活力水平 和蛋白水平。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1實(shí)施例1發(fā)酵結(jié)果
[0037] 圖2實(shí)施例2發(fā)酵結(jié)果
[003引 圖3實(shí)施例3發(fā)酵結(jié)果
[0039] 圖4對(duì)比例1發(fā)酵結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1:
[0041] 種子培養(yǎng)基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸錠，0. 3%憐 酸二氨鐘，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rc滅菌20min。
[0042] 產(chǎn)酶培養(yǎng)基：3%木糖渣，3%教皮，0. 2%微晶纖維素，0. 5%豆餅粉，0. 2%硫酸錠， 0. 1%尿素，0. 3%憐酸二氨鐘，0. 05%硫酸儀，0. 3%吐溫80,121°C滅菌30min。
[0043] 濾紙酶（FPA)酶活測(cè)定方法：發(fā)酵液8000巧m離屯、lOmin，取上清為粗酶液，用于 酶活力及蛋白含量測(cè)定。參照輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（地2583-2003)進(jìn)行測(cè)定，取適當(dāng)稀釋的粗 酶液0. 5血，W50mg(lcmX6cm)新華濾紙條為底物，加入抑4. 8醋酸緩沖液1. 5血和0. 5血， W不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)60min，取出，加入3mlDNS溶液，沸水浴中保持lOmin，水浴冷 卻，定容至25ml，混勻，在540皿處比色。
[0044] 化a壯ord法測(cè)定蛋白含量：W牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出 粗酶液中的蛋白含量。
[0045] 將草酸青霉JUA10-1劃線接種于教皮培養(yǎng)基中28~32°C培養(yǎng)7天，待長(zhǎng)出粉紅 色的抱子后轉(zhuǎn)接至新鮮教皮培養(yǎng)基培養(yǎng)5天作為菌種。接lcm2菌種接種于種子培養(yǎng)基中， 28~32°C20化pm發(fā)酵24~4她，制備成一級(jí)種子，按照5%~10%的接種量接種一級(jí)種 子于種子培養(yǎng)基中，28~32°C20化pm培養(yǎng)30~4化制成二級(jí)種子，然后將二級(jí)種子接種 于化產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在化保興發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào) GC-MS6800)進(jìn)行尾氣分析0UR、C邸指標(biāo)。（0UR與C邸指標(biāo)基本一致，W0UR進(jìn)行表征）。 [004引（1)抑調(diào)節(jié)：發(fā)酵開(kāi)始抑調(diào)整為5. 5-6. 0,發(fā)酵前期抑逐漸下降，用氨水控制渣 4. 0W上，中后期抑回升用憐酸調(diào)節(jié)抑至5. 5W下；（2)通氣量控制：每分鐘通氣量：發(fā)酵 體積=1:1 ; (3)溶氧調(diào)節(jié)：發(fā)酵起始溶氧調(diào)整至100%，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)攬拌轉(zhuǎn)速保 持溶氧在30%W上；(4)溫度調(diào)控：整個(gè)發(fā)酵過(guò)程溫度保持30°C; (5)發(fā)酵開(kāi)始，0UR隨菌 體濃度增加而逐漸升高，在該培養(yǎng)基條件下，在4化左右達(dá)到最高值，約23 (±5) -27 (±5) mmol/L/h，維持約10~1化后，隨著培養(yǎng)基中碳源和氮源的耗盡，發(fā)酵開(kāi)始出現(xiàn)碳氮源限 審IJ，反應(yīng)速