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一種提高植物耐非生物脅迫能力的方法

文檔序號:9501816閱讀:1791來源:國知局
一種提高植物耐非生物脅迫能力的方法
【專利說明】-種提高植物耐非生物脅迫能力的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種利用耐逆基因提高轉(zhuǎn)基因植物耐非生物 脅迫的方法。
【背景技術(shù)】
[000引在中國的鹽堿地面積約9913萬公頃,占世界總鹽堿地面積的10% ;運些±壤中往 往含有較多的可溶性鹽,造成生長在運種±壤上的植物細(xì)胞壁兩側(cè)體液滲透壓不同,使得 細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生程度的脫水,從而影響植物生長甚至造成死亡。在中度W上鹽堿化的±壤中, 只有少數(shù)具有較強(qiáng)耐鹽堿能力的高等植物能夠存活,但在同樣的環(huán)境中,有大量具有較強(qiáng) 耐鹽堿能力的微生物可W正常生長。
[0004] 嗜鹽菌是生活在鹽度較高環(huán)境中的一類細(xì)菌,它們可W生長在高鹽(一般10%~ 30%)條件下,主要發(fā)現(xiàn)于鹽湖、鹽場等濃縮咸水中,W及騰魚、咸菜等鹽制品上。中度嗜鹽菌 (Moderatelyhalophilicbacteria)是一類在3%~15%化Cl濃度之間有最佳生長狀態(tài)的 細(xì)菌,它們對環(huán)境中的鹽濃度適應(yīng)范圍較寬,對營養(yǎng)的要求很低,適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)。
[0005] 嗜鹽菌的鹽適應(yīng)機(jī)理包括:1、由于嗜鹽菌的質(zhì)膜和液泡膜上的累有K7化+逆 向轉(zhuǎn)運功能,擁有從環(huán)境中吸收濃縮r和向胞外或液泡內(nèi)排放化+的能力,嗜鹽菌采用在細(xì) 胞內(nèi)高度積累r來抵抗細(xì)胞外的高滲環(huán)境,造成嗜鹽菌本身雖然生長在鹽濃度比較高的環(huán) 境中,但是細(xì)胞內(nèi)的化+濃度并不高。2、嗜鹽菌大量產(chǎn)生內(nèi)溶質(zhì)或保留從外部取得的溶質(zhì), 如氨基酸等具有滲透保護(hù)作用的小分子物質(zhì),使它們能夠在高鹽濃度環(huán)境中保持細(xì)胞內(nèi)的 滲透壓,從而正常生活。3、嗜鹽菌的酶類對高鹽濃度具有適應(yīng)能力,在高鹽濃度下仍保持正 常、甚至比低鹽濃度時更高的活性,而不象其它生物的酶那樣會在高鹽濃度下失活。
[0006] 植物耐鹽設(shè)及多種機(jī)制和代謝途徑:1.質(zhì)膜和液泡膜上的多種離子轉(zhuǎn)運體和離 子通道蛋白,如液泡膜化7H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白、氨離子Ξ憐酸腺巧酶酶和氨離子焦憐酸化酶 等,在離子轉(zhuǎn)運和重建離子平衡發(fā)揮著重要的作用,保持細(xì)胞膨壓和維持正常的生化反應(yīng), 從而使植物在高鹽環(huán)境中能夠重建體內(nèi)離子平衡。2.氨基酸及其衍生物、糖醇類及其衍 生物等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),通過維持細(xì)胞的滲透壓、穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)W保護(hù)植物免 受高鹽脅迫傷害。運類物質(zhì)中研究較多的是脯氨酸和甜菜堿,它們在細(xì)胞中起著無毒滲透 保護(hù)劑的作用,其大量積累可保持許多代謝過程中的重要酶類的活性;植物中甜菜堿合成 途徑的兩個關(guān)鍵酶是膽堿單加氧酶(cholinemonooxygenase,CM0)和甜菜堿醒脫氨酶 化etainealdehydedehy化ogenase,BADH),向植物轉(zhuǎn)入外源膽堿脫氨酶基因可W催化乙 酷膽堿合成甜菜堿。3.具有一定耐鹽能力的植物細(xì)胞中的超氧化物歧化酶、過氧化氨酶、抗 壞血酸一谷脫甘膚循環(huán)中的酶類,在鹽脅迫下會過量表達(dá),清除細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生氧自由基、過 氧化氨化2〇2)和徑基自由基(0H)等活性氧(R0巧,減輕鹽脅迫的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種培育耐非生物脅迫能力提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0008] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下: 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)海桿菌必arino如cter5A,提取基因組DNA,用耐逆基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建入植物表達(dá)載體,此載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌,用根癌農(nóng)桿菌侵染擬 南芥,經(jīng)過抗除草劑篩選、自交、分子鑒定等步驟,得到純合轉(zhuǎn)基因擬南芥。用不同濃度化C1 溶液處理轉(zhuǎn)基因植株和對照非轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐旱能力與對照非轉(zhuǎn) 基因植株相比顯著提高,具體表現(xiàn)在存活率、葉片大小、葉綠素含量和植株重量等方面。
[0009] 上述方法中,所述耐逆基因為海桿菌甜菜堿醒脫氨酶基因(Aefc4),其核酸序列為 序列表中的序列1,氨基酸序列為序列表中的序列2; 所述耐鹽基因特異正反向引物序列分別為序列表中序列3和序列4 ; 上述方法中,所述耐逆基因W基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入目的植物;所述耐逆基因表 達(dá)盒具體包括花挪菜花葉病毒35S啟動子(pCaMV35S)、耐逆基因和nos終止子 (化OS),其序列為序列表中序列5,其中l(wèi)-828bp為花挪菜花葉病毒35S啟動子序列,其中 848-2542bp為耐逆基因序列,其中2561-2815bp為nos終止子序列; 上述表達(dá)盒中的耐逆基因的序列為基因編碼區(qū)序列。
[0010] 上述方法中,所述耐逆基因表達(dá)盒通過重組表達(dá)載體pTFlOl. 1-betA導(dǎo)入目的植 物中,其序列為序列表中序列6; 上述方法中,所述目的植物是雙子葉植物或單子葉植物。在本發(fā)明的實施例中采用的 雙子葉植物為擬南芥,具體生態(tài)型為Columbia。
[0011] 本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟: 1) 耐逆基因的獲得: 曰、在高鹽LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜鹽細(xì)菌(ifarinoAac妃r邱.);b、用細(xì)菌基因組DNA提取液提取細(xì)菌基因組DNA; C、用耐逆基因特異引物,從細(xì)菌基因組中PCR擴(kuò)增逆鹽基因;t耐逆基因利用酶切/連接方法,重組入植物表達(dá)載體,將此重組植物表達(dá)載體用熱 激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中,用LB液體培養(yǎng)基搖菌,菌液離屯、后的得到的菌體用堿裂解法 小量提取質(zhì)粒,經(jīng)過酶切、測序驗證; 2) 植物轉(zhuǎn)基因: a、 植物重組表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌; b、 根癌農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥; C、轉(zhuǎn)化的擬南芥結(jié)的種子經(jīng)除草劑Basta篩選,對抗性植株用Trizol法分別提取基因 組DNA和總RNA,分別W耐逆基因特異引物做PCR和反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)進(jìn)行分子鑒定, 經(jīng)過W上檢測步驟得到的植株為T1代轉(zhuǎn)基因植株; d.獲得耐逆基因純合轉(zhuǎn)基因植株:T1代轉(zhuǎn)基因植株自交得到T2代種子,種植T2代種 子并用除草劑Basta篩選,抗性植株繼續(xù)生長、結(jié)出T3代種子,種植T3代種子,用抗除草劑 Basta篩選,并根據(jù)其除草劑抗性,挑選已純合的T2代產(chǎn)生的純合T3代進(jìn)行后續(xù)耐逆表型 研究; 3) 轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定: a、 鹽脅迫后存活率分析; b、 鹽脅迫后植株大小分析; C、鹽脅迫后葉綠素含量分析;t干旱脅迫后植株重量分析; 上述方法中,步驟1)中,所述高鹽LB液體培養(yǎng)基,按照如下方法制備:向800ml蒸饋水 中分別加入lOg膜蛋白腺,5g酵母水解物,50g氯化鋼,攬拌充分溶解后,用蒸饋水水補(bǔ)足體 積1000ml,121°C高壓滅菌18分鐘后備用; 步驟1)中,所述細(xì)菌基因組DNA提取液成分為:Tris鹽酸40mM,醋酸鋼20mM,邸TA ImM,SDS1%,pH7. 8 ; 步驟1)和步驟2)中,所述PCR及RT-PCR擴(kuò)增程序為預(yù)變性95°C5分鐘;30個循環(huán): 95°C30秒,56°C45秒,72°C100秒;72°C延伸10分鐘;所述PCR及RT-PCR反應(yīng)體系為:細(xì) 菌基因組DNA或植物基因組DNA或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA2yl,dNTPs(2. 5mM) 1μ1,正向引物 (2. 5μΜ) 1μ1,反向引物(2. 5μΜ)1μ1,10ΧPCRbuffer2yl,rTaq0. 2μ1,Η2〇 13μ1。
[0012] 步驟2)中,所述LB培養(yǎng)基成分為:膜蛋白腺1%,酵母水解物0.5%,氯化鋼1%;在 配制固體LB培養(yǎng)基時,還需加入瓊脂使其終濃度為2%。
[0013] 步驟2)中,所述除草劑為Basta(草下麟),濃度為5mg/L。
[0014] 步驟2)中,所述根癌農(nóng)桿菌為具體為GV3101。
[0015] 本發(fā)明的實驗證明,采用本發(fā)明的方法,可將耐逆基因,通過根癌農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)入 植物,得到轉(zhuǎn)基因植株與野生型植物相比,在高鹽和干旱脅迫情況下,具有顯著增強(qiáng)的耐逆 能力。
【附圖說明】
[0016] 圖1 :a. 基因編碼區(qū)PCR、酶切產(chǎn)物;b.載體pTFlOl. 1酶切產(chǎn)物 圖2:菌落PCR檢測結(jié)果 圖3 :轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果,wt:非轉(zhuǎn)基因植株對照山2 :不同的轉(zhuǎn)
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