貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時熒光定量pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，尤其設(shè)及貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時 巧光定量PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Q熱怕化ver)是一種能使人和多種動物感染而產(chǎn)生發(fā)熱的一種疾病，病程可分 為急性期和慢性期。急性感染的癥狀包括：高熱、顫抖、肌肉疼痛和頭疼等，更嚴(yán)重的會導(dǎo)致 肺炎或肝炎。懷孕期間被感染時，有可能導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)或新生兒早產(chǎn)。大約有1%的感染最 終轉(zhuǎn)變成慢性疾病。1950年，我國首例發(fā)現(xiàn)Q熱病例，隨后在屠宰場、農(nóng)牧場等地多次暴發(fā) 流行，病原體分別從五十多種野生動物中分離出。目前此病已遍及全世界，中國已有十多個 省份存在此病。
[0003]Q熱于1937年初在澳大利亞的布里斯班大規(guī)模爆發(fā)后，化.HeraldRaeCox 等成功地分離了除了病原菌，并用他們的名字命名為貝納特氏立克次體巧ickettsia burneti)，又名貝氏立克次體（Coxiellaburnetii),屬立克次體。近幾年研究將其從斑點(diǎn) 熱立克次體中分離出來，屬于非斑點(diǎn)熱群立克次體，該菌為革蘭陰性菌。其致病性、免疫原 性與其脂多糖、質(zhì)粒、表面蛋白等方面密切相關(guān)。對理化因子有特殊的抵抗力，在外界環(huán)境 中可長期存活，可通過氣溶膠廣泛傳播，通過飛沫方式使人和動物發(fā)生感染。貝氏立克次體 是立克次體族中目前已知唯一含有質(zhì)粒的病原菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種質(zhì)粒型怕pHI、化RS、化DV、 化DG)和無質(zhì)粒（plasmidless)。每種質(zhì)粒各有其特異序列，并且質(zhì)粒的類型與Q熱的臨床 類型無關(guān)。大多病癥是亞臨床癥狀或不被確診。
[0004] 檢測貝氏立克次體最可靠依據(jù)是從樣本中分離到貝氏立克次體，可用動物分離、 雞胚分離、細(xì)胞分離等手段，但是貝氏立克次體的分離耗時、繁瑣、敏感性差，在一般實驗室 難W進(jìn)行。目前，最常用的貝氏立克次體檢測方法是血清特異性抗體檢測，由于高水平的特 異性抗體出現(xiàn)較晚，所W特異性抗體的檢測結(jié)果難W用作Q熱的早期診斷，也無法用于檢 測樣品是否攜帶該病菌。因此，急需提供一種能夠準(zhǔn)確、快速檢測貝氏立克次體的試劑盒及 其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時巧光定 量PCR方法。采用該引物組及其檢測試劑對貝氏立克次體進(jìn)行檢測，能夠具有良好的特異 性、重復(fù)性和靈敏性。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種貝氏立克次體的檢測引物組，包括如SEQIDNO:1所示核巧酸 序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物。
[000引本發(fā)明還提供了一種貝氏立克次體的實時巧光定量PCR檢測試劑，包括如SEQID NO:1所示核巧酸序列的上游引物、如SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物和如SEQID NO:3所示核巧酸序列的探針。
[0009] 本發(fā)明W貝氏立克次體的保守序列作為檢測祀目標(biāo)，提供用于貝氏立克次體的巧 光定量檢測的探針和引物，W該引物和探針對貝氏立克次體進(jìn)行檢測，能夠具有良好的特 異性、重復(fù)性和靈敏性。
[0010] 在本發(fā)明中，如SEQIDNO: 3所示核巧酸序列的探針的3'端連接有FAM巧光標(biāo)記 基團(tuán)。
[0011] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的檢測試劑中還包括dNTP、Taq酶和/或PCR反應(yīng)緩沖液。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的檢測試劑中還包括d地2〇、96孔板和/或光學(xué)反應(yīng)蓋膜。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種非診斷目的檢測貝氏立克次體的實時巧光定量PCR方法，包 括如SEQIDN0:1所示核巧酸序列的上游引物、如SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下 游引物擴(kuò)增待測樣品DNA，W如SEQIDN0:3所示核巧酸序列的探針檢測，經(jīng)實時巧光定量 PCR獲得巧光信號。
[0014] 作為優(yōu)選，實時巧光定量PCR的反應(yīng)體系為：
[0015]
[0016]
[0017] 采用本發(fā)明提供的實時巧光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增能夠獲得良好的擴(kuò)增曲 線，提高實驗的準(zhǔn)確性。
[0018] 作為優(yōu)選，實時巧光定量PCR的程序為：
[0019]
[0020] 烙解溫度燈m)是引物的一個重要參數(shù)。運(yùn)是當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙 鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠 低，W保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，W減少非特異性結(jié)合。本發(fā)明提供 的巧光定量PCR引物退火溫度為57°C，W此溫度檢測，能夠提高實驗的特異性。
[002。 作為優(yōu)選，SEQIDN0:1所示核巧酸序列的上游引物的濃度為lOpmol/L;SEQID N0:2所示核巧酸序列的上游引物的濃度為lOpmol/L。
[0022] 作為優(yōu)選，SEQIDN0:3所示核巧酸序列的探針的濃度為lOpmol/L。
[0023]根據(jù)巧光信號值及擴(kuò)增曲線獲得樣品中是否含有貝氏立克次體，具體為：
[0024] 巧光信號Ct值< 28. 0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，試驗有效；
[00巧]無巧光信號Ct值或無擴(kuò)增曲線，待測樣品為陰性，不含貝氏立克次體；
[0026] 巧光信號Ct值《30.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，待測樣品為陽性，含有貝氏立克 次體。
[0027] 本發(fā)明提供了貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時巧光定量PCR方 法。該引物組包括如SEQIDNO: 1所示核巧酸序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核巧 酸序列的下游引物。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0028] 1、采用本發(fā)明提供的引物組進(jìn)行實時巧光定量PCR方法擴(kuò)增效率為101%，相關(guān) 系數(shù)為0. 999,說明誤差小，結(jié)果客觀準(zhǔn)確；
[0029] 2、采用本發(fā)明引物組進(jìn)行實時巧光定量PCR方法對貝氏立克次體進(jìn)行檢測，具有 良好的特異性，通過擴(kuò)增只有貝氏立克次體出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其它未有S型曲線擴(kuò)增；
[0030] 3、本發(fā)明重復(fù)性檢測的巧光PCR的Ct變異系數(shù)最小可達(dá)0. 16%，梯度重復(fù)性良 好，表明本發(fā)明檢測方法重復(fù)性良好且穩(wěn)定，所檢測到的Ct值近似或根據(jù)稀釋倍數(shù)呈現(xiàn)梯 度曲線；
[003。4、本發(fā)明實時巧光定量PCR方法能檢出的最低拷貝數(shù)為1.55Xl05copies/yL，巧 光PCR的敏感度均較高。
【附圖說明】
[0032] 圖1示按照實施例1的反應(yīng)體系及條件分別對不同菌進(jìn)行檢測的結(jié)果；線1示貝 氏立克次體擴(kuò)增曲線，其余菌未擴(kuò)增出擴(kuò)增曲線。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明公開了貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時巧光定量PCR方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。
[0034] 本發(fā)明提供的貝氏立克次體的檢測引物組及其檢測試劑、實時巧光定量PCR方法 中采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0035] 貝氏立克次體標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：
[0036] 首先，根據(jù)NCBI公布的貝氏立克次體ISllla基因序列合成目的基因（序列見SEQ IDN0:4,上海生物工程有限公司合成）與PMD18T載體燈AKARA公司）連接后轉(zhuǎn)入大腸桿 菌里，直接提取質(zhì)粒DNA;
[0037] 質(zhì)粒作為貝氏立克次體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實驗。質(zhì)粒的260nm/280nm比值為2. 0,濃度為 56.OOng/μL〇
[0038] 提取待測樣品DM所用緩沖液ATL、緩沖液AL、緩沖液AWl、緩沖液AW2、緩沖液AE、 QIAampMinispincolumn收集管來自DM提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0039] 下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[004