一種沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT2的sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抑制0SCAT2基因表達(dá)的SgRNA及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化氨酶（Catalase,CAT)是第一個被發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，Loew將其命名為 Catalase。氧化氨酶是生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一。其生物學(xué) 功能是催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氨的分解防止過氧化。CAT與S0D、P0D、ASP-起被稱為酶保護(hù)系 統(tǒng)。前認(rèn)為植物中CAT主要存在于過氧化物酶體與乙醒酸循環(huán)體中，同時與葉綠體和線粒 體存在著密切聯(lián)系。一個典型CAT相對分子質(zhì)量大約為200~340ku，是由4個亞基構(gòu)成 的聚合體，每個亞基各含有1個亞鐵血紅素分子，保守序列存在于催化位點(diǎn)和亞鐵血紅 素的結(jié)合位點(diǎn)，在簇基末端存在著可能識別過氧化物酶體的多膚序列PTSUperoxisomal targetingsignal),結(jié)合的NADPH可能對維護(hù)自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到重要作用。
[0003]CATs家族由多基因編碼，在煙草、擬南芥、玉米、南瓜和大米等都發(fā)現(xiàn)Ξ種過氧化 氨酶基因。研究發(fā)現(xiàn)，CAT的表達(dá)具有組織和器官特異性。在正常生長條件下，玉米CAT2在 盾片、葉、上胚軸及未成熟果實(shí)內(nèi)均有表達(dá)；擬南芥CAT2、CAT2和CAT3在花序和種子內(nèi)都 表達(dá)，CAT2和CAT3在葉中表達(dá)量高；藍(lán)麻CAT2主要在胚乳和胚軸中表達(dá)。機(jī)械損傷、鹽脅 迫、低溫和高溫脅迫和紫外脅迫等都能導(dǎo)致CAT基因表達(dá)量的明顯變化。
[0004] 隨著研究的不斷深入，過氧化氨酶在植物防御、脅迫應(yīng)答W及控制細(xì)胞的氧化還 原平衡等方面起著重要的作用越來越受到人們的關(guān)注，其抗低溫、干旱、病毒W(wǎng)及除草劑的 功能已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中得到驗(yàn)證。過氧化氨酶作為信號分子的過氧化氨是植物復(fù)雜信號 傳導(dǎo)中的一個重要組成部分，它介導(dǎo)了多種植物脅迫反應(yīng)并對其平衡的維持和調(diào)控起到 了非常重要的作用。越來越多的研究證實(shí)了脅迫反應(yīng)中過氧化氨酶與過氧化氨含量的變化 有一定的關(guān)系，同時又和其它信號因子存在著交互作用。
[0005]CRISPR/tas9是一種來源于原核生物的新型核酸酶系統(tǒng)，它由導(dǎo)向序列SgRNA和 核酸酶化s9兩種元件組成。SgRNA可識別基因組中核甘酸序列為5'-NGG-3'的前間區(qū)序列 鄰近基序（PAMmotif),依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則與祀向序列結(jié)合，Cas9在sgRN的導(dǎo)向下，特 異性切割祀向序列，導(dǎo)致序列變化。與ZFN、TALEN相比，CRISPR/tas9系統(tǒng)具有操控性強(qiáng)、 特異性高、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 精確祀向目標(biāo)基因是BGK03能否特異性沉默目標(biāo)基因的先決條件，無論是脫祀還 是錯誤祀向，都會影響B(tài)GK03對目標(biāo)基因的特異性沉默。設(shè)計(jì)、制備出精確性和特異性祀向 目標(biāo)基因的SgRNA成為BGK03基因沉默的關(guān)鍵技術(shù)。
[0007] 水稻的ryza sativa L.)是最主要的糧食作物之一，全世界超過一半的人口都W 水稻作為主糧。水稻不僅是一種重要的糧食作物，也是一種重要的模式生物，對相關(guān)基因 進(jìn)行功能研究具有重要的作用。CAT基因在植物的脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著越來越重要的作用， 但其是否還具有其它功能還不清楚，我們的研究發(fā)現(xiàn)水稻中0SCAT2基因的沉默會影響植 株的分葉及育性，運(yùn)暗示其可能在水稻的營養(yǎng)和生殖生殖發(fā)揮作用。通過在水稻體內(nèi)降低 OsCAT2基因的表達(dá)水平為將為水稻的遺傳改良提供重要的理論依據(jù)和新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種抑制水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的方法，提供了一種 沉默水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的sgRNA，及祀向沉默水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的載體 構(gòu)建方法。
[0009] 本發(fā)明中，一種沉默水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的sgRNA，其DNA序列如SEQ IDN0. 1 所示。
[0010] 本發(fā)明中，祀向沉默水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的載體，其特征在于：含有特異 性祀向0SCAT2基因第Ξ外顯子的sgRNA的表達(dá)載體和化s9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，其中 sgRNA序列上游為水稻U6啟動子，化s9上游為玉米加強(qiáng)型啟動子，篩選標(biāo)記為潮霉素。
[0011] 本發(fā)明祀向沉默水稻過氧化氨酶基因0SCAT2的載體構(gòu)建方法，按W下步驟進(jìn)行：
[0012] (1)根據(jù)在線軟件ht1:p://c;risp;r.mit.edu/捜尋 0SCAT2 (X0C_0s06巧 1)基因的合 適的祀標(biāo)序列，0SCAT2的序列特征見SEQNO6所示，祀標(biāo)序列見SEQIDN0. 2所示。
[001引 似將祀標(biāo)序列去除末端TGG，獲得sgRNA序列，其DNA序列見SEQIDN0. 1所示； 將SEQIDN0. 1序列反向互補(bǔ)獲得sgRNA的反向互補(bǔ)序列，其DNA序列見SEQIDN0. 3所示。
[0014] 做在SgRNA序列的5端引入6個額外的堿基TGTGTG獲得SEQIDNO. 4序列；在 SgRNA反向互補(bǔ)序列的5端引入4個額外的堿基AAAC，3端引入2個額外的堿基CA獲得SEQ IDNO. 5序列。人工合成沈QIDNO. 4和沈QIDNO. 5的序列后并將其制備成Oligo二聚 體；
[0015] (4)將制備好的Oligo二聚體連接至載體BGK03的U6啟動子上游，然后轉(zhuǎn)化大腸 桿菌D冊a獲得載體BGK03-0SCAT2。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是載體BGK03-0SCAT2轉(zhuǎn)化水稻后，即可實(shí)現(xiàn)高效、快速、特異 對水稻0SCAT2基因進(jìn)行沉默。轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片變小、分葉數(shù)增多及育性降低的表型。 可直接用此做研究材料來探討0SCAT2基因的功能和作用機(jī)理，為在生產(chǎn)實(shí)踐上更好利用 0SCAT2基因進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的水稻0SCAT2基因的目標(biāo)祀位點(diǎn)。小寫字母代表內(nèi)含子，大寫字母 代表外顯子。
[0018] 圖2為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻中0SCAT2基因目標(biāo)祀序列的比對結(jié)果。A為野生型水 稻9522,B-C為轉(zhuǎn)基因水稻，陰影部分為目標(biāo)祀序列。
[0019] 圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻中0SCAT2基因突標(biāo)祀序列的峰圖。A為野生型水稻 9522,B-C為轉(zhuǎn)基因水稻，框內(nèi)所示序列為目標(biāo)祀序列。
[0020] 圖4為轉(zhuǎn)基因水稻植株；其中A，C，E為野生型，B，D，F(xiàn)為轉(zhuǎn)基因水稻。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，運(yùn)些實(shí)施例僅用于舉例說明 本發(fā)明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0022] 實(shí)施例中所設(shè)及的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、各種限制性內(nèi)切酶、化q DM聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司（大連）產(chǎn)品，質(zhì) 粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，BGK03載體購自杭州百格生物技 術(shù)公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)W及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所 有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無 特別說明均為常規(guī)方法。
[0023] 實(shí)施例1 :水稻0SCAT2基因目標(biāo)祀序列的獲得
[0024] 利用tigr在線數(shù)據(jù)庫查找水稻0SCAT2基因L0C_0s06g51并下載。根據(jù)在線軟件 httpV/crispr. mit.edu/捜尋0sCAT2基因5' (N)20NGG-3'序列，并根據(jù)祀向位點(diǎn)，錯配堿 基數(shù)、錯配位置等進(jìn)行優(yōu)化，最后選擇其反義鏈上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作為目標(biāo) 祀序列，見圖1.
[00巧]實(shí)施例2 :水稻BGK03-0SCAT2載體的構(gòu)建
[002引 （1)sgRNA序列：目標(biāo)祀序列反向互補(bǔ)后去除5端序列TGG得到sgRNA序列
[0027] "GTGGAGAACCGAACAATAAC"
[0028] 似SgRNA反向互補(bǔ)序列：將SgRNA序列反向互補(bǔ)獲得反向互補(bǔ)序列
[0029] "GTTATTGTTCGGTTCTCCAC"。
[0030] (3)根據(jù)選擇的載體BGK03的酶切位點(diǎn)，在SgRNA序列的5端引入6個額外的堿基 TGTGTG獲得SEQ ID NO. 4序列；在SgRNA反向互補(bǔ)序列的5端引入4個額外的堿基AAAC，3 端引入2個額外的堿基CA獲得SEQ ID NO. 5序列。將SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的序 列交由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行人工合成分別得到UPOligo和LowOligo。
[0031] (4)Oligo二聚體的制備：
[0032] 將合成的Oligo加水溶解至10μM，按下列反應(yīng)體系混合后，95°C加熱3分鐘，然后 W約0. 2°C/秒緩慢降至20°C，反應(yīng)在博日PCR上進(jìn)行。反應(yīng)體系為：
[0033]BufferAnneal 18ul
[0034]UPOligo 1μ 1
[0035]LowOligo 1μ 1
[0036] 巧）將Oligo二聚體構(gòu)建至BGK03載體。
[0037] 按下列反應(yīng)體系在冰上混合各個組分