一種提高人金屬硫蛋白mt4原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種提高人金屬硫蛋白MT4原核表達(dá)載體 表達(dá)量的方法。
【背景技術(shù)】
[000引金屬硫蛋白（Metallothionein，MT),又稱琉基金屬結(jié)合蛋白。一類非酶蛋白質(zhì)， 除含有儒（Cd)、鋒狂η)的MT外，在自然界也存在含有銅（Cu)、隸化Z)、金（Au)、祕度i)等 元素的MT。MT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生 解離的抑值分別為：Zn-MT:3. 5~4. 5 ;Cd-MT:2. 5~3. 5 ;化-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨 基酸，故在280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有 一個(gè)吸收峰。所有脊椎動(dòng)物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘導(dǎo) 產(chǎn)生的MT，其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。目前產(chǎn)品主要從兔肝、 馬腎、豬肝和微生物（如粗脈抱菌）等中提取。
[0003] 關(guān)于金屬硫蛋白的功能和開發(fā)利用，自1978年到1999年先后在瑞±、日本、美國 共舉行了四次國際專題研討會(huì)，第五次國際專題研討會(huì)于2005年10月在北京召開。1987 年我國將MT列入[863]計(jì)劃，"八五"、"九五"重大攻關(guān)項(xiàng)目，1994年列入國家級(jí)[火炬計(jì) 劃];2003年MT項(xiàng)目被國家科技部列為"國家科技成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃項(xiàng)目，1995年聯(lián)合國 將MT列入向世界各國推薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對(duì)MT的研究、開發(fā)、推 廣、應(yīng)用的高度重視。
[0004] 關(guān)于MT蛋白的生物發(fā)酵生產(chǎn)，曾經(jīng)有用大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌、酵母菌等基 因工程重組方法，但均由于表達(dá)量過低而至今未有投入生產(chǎn)。
[0005]MT4在主要存在于人類皮膚組織中。皮膚是人類最大的器官，外界灰塵中和污染物 中（如含鉛化妝品中）的重金屬可W通過接觸皮膚而被吸收，各種福射（如太陽光的紫外 等）可W導(dǎo)致皮膚和皮下產(chǎn)生自由基，從而加速皮膚的膠原纖維、彈性纖維老化（被自由基 氧化）而失去彈性，被氧化的細(xì)胞衰老調(diào)亡，被氧化的DNA容易突變致癌，因此，皮膚除了有 全身分布的MT1和MT2外，還重點(diǎn)"布防"有MT4,故而MT4具有皮膚組織特異性，是皮膚重 金屬入侵防護(hù)和延緩皮膚衰老的重要因子，在護(hù)膚、延緩衰老、緩解皮膚過敏的抗衰美容日 化產(chǎn)品中有重要用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于W上表達(dá)量不足的缺陷，本發(fā)明的主要目的是利用人工基因全合成的方法將 密碼子優(yōu)化，并且將表達(dá)子首尾串聯(lián)重復(fù)4次成為包含4拷貝MT4順反子的原核巧.coli) 表達(dá)載體，用W提高表達(dá)量。
[0007] -種提高人金屬硫蛋白MT4原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法，包括將含經(jīng)密碼子優(yōu)化 后的人金屬硫蛋白分子MT4的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達(dá)載體克隆區(qū)串聯(lián)重復(fù)4次形成 包含4拷貝人金屬硫蛋白MT4順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū)；將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 原核宿主細(xì)胞；培養(yǎng)并大量繁殖該細(xì)胞，利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子MT4表達(dá)。
[0008] 本發(fā)明方法還可進(jìn)一步包括利用現(xiàn)有技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的人金屬硫蛋白MT4進(jìn)行 分離純化的步驟。
[0009] 其中，每個(gè)所述的串聯(lián)單位優(yōu)選包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫 蛋白分子MT4。
[0010] 每個(gè)所述的串聯(lián)單位還優(yōu)選包括位于串聯(lián)單位兩端的酶切位點(diǎn)。
[0011] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4編碼區(qū)序列優(yōu)選如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQIDNO. 2所示。
[0013] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子的編碼區(qū)基因序列，其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0014] 一種用于提高人金屬硫蛋白MT4原核表達(dá)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)由 串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成；所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金 屬硫蛋白MT4的編碼區(qū)。
[0015] 所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列優(yōu)選自SEQIDNO. 5~SEQIDNO. 8中的任意一種。
[0016] 一種表達(dá)人金屬硫蛋白MT4的原核表達(dá)載體，所述的原核表達(dá)載體含有本發(fā)明所 述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
[0017] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1、所述人MT4蛋白的優(yōu)化密碼子提高了大腸桿菌內(nèi)該類密碼的可獲得性。
[0019] 2、所述MT4原核表達(dá)載體中MT4表達(dá)順反子增加了近3倍，MT4的平均表達(dá)量由 單拷貝時(shí)的3. 4%增加到平均8. 9%，表達(dá)量增加了 2. 6倍；
[0020] 3、所述MT4原核表達(dá)載體表達(dá)的MT4蛋白為天然單分子，并非融合蛋白。
【附圖說明】
[002。 圖1為本發(fā)明提供的一種MT4串聯(lián)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 注解：示意圖中所代表的DNA序列為所構(gòu)建的原核表達(dá)載體的一部分，W "TTpromoter"開始，W"T7te;rminato;r"結(jié)束；"Lacoperator"為laci結(jié)合位點(diǎn)；"RBS"為 核糖體結(jié)合序列。"T7terminator"為T7隧菌體的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列。
【具體實(shí)施方式】
[0023]W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不作對(duì)本發(fā)明的限 定。
[0024] 采用的技術(shù)方案如下：
[00巧]首先，本發(fā)明第一步將人MT4共四種亞型的MT蛋白分子翻譯成cDNA序列，然后經(jīng)DM2. 0軟件優(yōu)化MTcDNA的密碼子，使其更適合于大腸桿菌的密碼子偏好，并且對(duì)氨基端 的起始15個(gè)氨基酸編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，避免強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4 編碼區(qū)序列優(yōu)選如SEQIDNO. 1所示。
[0026] 第二步是用寡核巧酸分步延伸法合成MT4的全長序列，5'端添加化〇1酶切位點(diǎn)， 3'端依次添加Spel---Nhel兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)化01/化el雙酶切純化后，定容至 50ng/ul，再將原核表達(dá)載體祀T28a(+)經(jīng)化〇1/化el酶切純化，定容至10化g/ul。
[0027]第Ξ步，連接與轉(zhuǎn)化：
[0028] mb(或MT2a,ΜΤ3,ΜΤ4)DNA巧Ong/ul) 2ul
[0029]pET28a(+)載體DNA(100ng/ul) 2ul
[0030]lOXT4DNA連接酶緩沖液 lul
[0031]T4DNA連接酶（200U/ul) lul
[0032] 消毒去離子水 4ul
[0033] 1300巧m，離屯、5s，混勻，再同法離屯、一次，室溫靜置連接2小時(shí)。
[0034] 全部lOul轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌，經(jīng)靜置30m，熱激Im，加入1mlLB后，37度震蕩培 養(yǎng)比后，離屯、4m化00化pm，EP離屯、機(jī)），棄上清，懸浮沉淀物，均勻涂布于含卡那霉素的軟 瓊脂平皿上，37度溫箱過夜培養(yǎng)。次日調(diào)取克隆，PCR鑒定陽性重組體，陽性克隆經(jīng)測序分 析正確后，得到包含1拷貝MT4順反子的克隆。
[0035] 接著進(jìn)行第一次串聯(lián)連接：
[0036] 取正確克隆1株，分別用兩管做酶切：管-1用酶Spel/BamHI雙切，回收大片段 巧.5化左右）作為載體；管-2用酶甜al/BamHI雙切，回收23化PS的片段。連接管-1和 管-2的回收產(chǎn)物，經(jīng)鑒定和DNA測序分析后，得到包含2拷貝MT順反子的MT4重組表達(dá)載 體。
[0037] 第二步串聯(lián)連接：采用第一步串聯(lián)連接產(chǎn)物（包含2拷貝MT順反子的正確克?。?管-1用SpelAhoI酶切，回收大片段（載體巧拷貝MT順反子）；管-2用甜alAhoI酶切， 回收53化PS的DNA片段（包含2拷貝MT順反子）。再經(jīng)連接鑒定后，即可得到4拷貝MT4 順反子的MT4原核表達(dá)載體，其中含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQ IDNO. 2 所示。
[0038] 小量搖瓶表達(dá)比較：
[0039] 分別取祀T28a(+)空載體、MT單拷貝、2拷貝、4拷貝的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)表達(dá)菌株，挑取單菌落分別接種4ml2XYT培養(yǎng)基（含50ug/ml卡那霉素）， 37°C，250巧m，震蕩培養(yǎng)，待到細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期，分別向各管加入0. 4ulIPTG，25°C誘 導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)。收集1ml菌液，離屯、沉淀，PBS洗一次，再用500ulPBS懸浮，超聲破碎細(xì) 胞，12000巧m/15分鐘，4°C離屯、棄沉淀，取上清上樣20%SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)顯色，脫 色，凝膠成像儀計(jì)算目標(biāo)條帶占總蛋白的比例，結(jié)果（如下）顯示隨拷貝數(shù)增加，表達(dá)量增 高（按目標(biāo)條帶密度占總蛋白密度百分比計(jì)算）。
[0040] 表1.不同MT4拷貝數(shù)載體在小量搖菌條件下目標(biāo)條帶密度占總蛋白密度百分比
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高人金屬硫蛋白MT4原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法，其特征在于包括將含經(jīng)密 碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子MT4的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達(dá)載體克隆區(qū)串聯(lián)重 復(fù)4次形成包含4拷貝人金屬硫蛋白MT4順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū)；將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞；培養(yǎng)并大量繁殖該細(xì)胞，利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子 MT4表達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于每個(gè)所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子MT4。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于每個(gè)所述的串聯(lián)單位還包括位于串聯(lián)單位 兩端的酶切位點(diǎn)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4編碼區(qū)序列如SEQ IDNO. 1 所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MT4編碼 區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQIDNO. 2所示。6. 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子的編碼基因序列，其特征在于核苷酸序列如 SEQIDNO. 4 所示。7. -種用于提高人金屬硫蛋白ΜΤ4原核表達(dá)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其特征在于所述的串聯(lián) 重復(fù)區(qū)由串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成；所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化 后的人金屬硫蛋白ΜΤ4的編碼區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其特征在于所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQID NO. 2所示。9. 一種表達(dá)人金屬硫蛋白MT4的原核表達(dá)載體，其特征在于所述的原核表達(dá)載體含有 權(quán)利要求9或10所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高人金屬硫蛋白MT4原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法。該方法包括：人工合成密碼子優(yōu)化的MT4的DNA分子，該分子還包括DNA內(nèi)切酶識(shí)別序列NcoI、SpeI、NheI；將所述DNA分子構(gòu)建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆區(qū)；再經(jīng)過系列重組使包含核糖體結(jié)合區(qū)的MT4編碼基因擴(kuò)增到4拷貝。本發(fā)明的方法適用于所有小分子多肽(100個(gè)氨基酸以內(nèi)的)表達(dá)載體的構(gòu)建，整個(gè)過程操作簡單，快速，所制備的原核表達(dá)載體提高了MT4蛋白的表達(dá)量，降低了成本，提高了工作效率。
【IPC分類】C12N15/69, C12N15/12, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105255929
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510702821
【發(fā)明人】李萬波
【申請(qǐng)人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月26日