豬PPARγ小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明設(shè)及一種豬PPAR丫（pPPAR丫）基因小干擾RNA(siRNA)表達(dá)載體的構(gòu)建方 法及用途，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisomeproliferators-activeted rec巧tors,PPARs)屬于核激素受體超家族成員，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。近年來 許多研究表明，PPARs在脂肪細(xì)胞分化、脂肪代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)可W影響 一些脂肪因子的分泌。PPARs有3種亞型，分別是PPARα(NR1C1)、PPARβ/δ(NRC2)和 PPAR丫（NRC3)。PPAR丫主要在脂肪組織、巨隧細(xì)胞、血管平滑肌中表達(dá)。PPAR丫是脂肪細(xì)胞 基因表達(dá)和膜島素細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)者，參與脂肪細(xì)胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)， 與肥胖的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，開展PPAR丫在動(dòng)物脂肪代謝和肌肉發(fā)育中的功能研 究具有重要的意義。
[0003]RNA干擾（RNAinterference,RNAi)是近年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)基因阻斷技術(shù)， 它是指由21~23堿基對(duì)的短雙鏈RNA、即小干擾RNA(smallinte計(jì)eringRNA，siRNA)在 真核細(xì)胞中引導(dǎo)序列特異性的內(nèi)源或外源性祀mRNA降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的現(xiàn)象。 siRNA技術(shù)是目前簡單而高效阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)的最有效方法，已廣泛用 于基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及腫瘤基因治療等研究。由于干擾載體pSilencer4. 1-CMVneo 可W方便用于目的基因SiRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，從而可W特異性的使特定目的基因沉默， 功能喪失，因此干擾載體pSilencer4. 1-CMVneo可W作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功 能基因組的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法， W及該小干擾RNA表達(dá)載體的用途。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方 法，包括W下步驟：
[000引 1)、根據(jù)載體的信息和豬PPAR丫序列（豬PPAR丫全長基因序列）設(shè)計(jì)并合成4 對(duì)含9個(gè)核巧酸的loop環(huán)的SiRNA引物，所述9個(gè)核巧酸為：TTCAAGAGA;
[0007]目P，是根據(jù)載體的信息和祀序列設(shè)計(jì)并合成上述SiRNA引物；
[0008]2)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建：雙酶切的RNAi載體與SiRNA引物退火后產(chǎn)物連接轉(zhuǎn) 化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。
[0009] 作為本發(fā)明的pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的改進(jìn)，步驟1)為：根據(jù) pPPAR丫全長基因序列，篩選并設(shè)計(jì)4對(duì)SiRNA引物；該4對(duì)SiRNA引物分別為：
[0010] 引物I:
[0011]8:5' -GATCCCTTTGGGATCAGCTCTGTGTTCAAGAGACACAGAGCTGATCCCAAAGTTA-3'
[0022] 作為本發(fā)明的pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2) 為：將pSilencer 4. 1-CMV neo質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切后，與siRNA引物退火 后得到的DNA片段連接，采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌；得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。
[0023] 作為本發(fā)明的pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，將步驟2) 所得的RNAi表達(dá)載體進(jìn)行鑒定：
[0024] 通過抗生素篩選，將陽性克隆采用PCR和測(cè)序鑒定；PCR反應(yīng)的引物為特異 性上游引物（即，上述引物I~引物IV中的上游引物）和RNAi干擾載體的本身引物： 5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';測(cè)序引物為：5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。
[00巧]本發(fā)明還同時(shí)提供了按照上述方法所得的pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的用途： 用于抑制豬PPART基因的表達(dá)。具體為：用于研究pPPAR γ基因?qū)ωi脂肪代謝及關(guān)鍵基因 ATCL等產(chǎn)生的影響。
[0026] 作為本發(fā)明的豬PPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的用途的改進(jìn)，包括W下步驟：
[0027](1)、將含pPPAR丫的SiRNA表達(dá)載體的大腸桿菌擴(kuò)培后，提取高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒；
[0028] (2)、將含pPPAR丫的SiRNA表達(dá)載體的高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬脂肪細(xì)胞等細(xì)胞， 37°C，5%的C〇2中保溫4~化后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；
[0029] (3)、轉(zhuǎn)染4化后，分析SiRNA表達(dá)載體對(duì)pPPAR丫及脂肪代謝關(guān)鍵功能基因ATCL、 服L、PPAR丫等表達(dá)的影響，研究pPPAR丫的功能。
[0030] 本發(fā)明的pPPAR丫小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其用途，具有W下有益效 果：
[0031] 本發(fā)明根據(jù)pSilencer4. 1-CMVneo載體信息和祀序列設(shè)計(jì)并合成了 4對(duì)siRNA 引物，siRNA引物經(jīng)退火后與雙酶切的pSilencer4. 1-CMVneo載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 D冊(cè)α，構(gòu)建得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒，經(jīng)篩選和條件優(yōu)化后，構(gòu)建好的RNAi表達(dá)載 體對(duì)pPPAR丫具有較好的干擾效果。本發(fā)明是利用RNAi技術(shù)，開拓了目前研究豬脂肪代 謝調(diào)控和基因功能研究的新思路。此法所用的RNAi表達(dá)載體pSilencer4. 1-CMVneo vector方便易得，載體構(gòu)建方法簡單、可行，同時(shí)構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體能夠特異、高效地抑 制pPPAR丫基因的表達(dá)，是研究pPPAR丫功能的一種強(qiáng)有力的研究技術(shù)，為開展pPPAR丫在 豬脂肪代謝和肌肉發(fā)育中的功能研究具有重要的意義。
【附圖說明】
[0032] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033] 圖1是siRNA引物退火后電泳檢測(cè)圖；
[0034] 圖中：1 ---RSL2---RS2,3RS3,4RS4,5Control；
[0035]圖 2 是BamHI/Hindlll消化pSilencer4. 1-CMV后的電泳檢測(cè)圖；
[0036] 圖中：Μ---DNAmarker, 1 質(zhì)粒，2---雙酶切質(zhì)粒；
[0037] 圖3是PCR產(chǎn)物檢電泳撿測(cè)圖；
[0038] 圖中：Μ-DMmarker;RS1~RS4 -陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；
[0039] 圖4是質(zhì)粒EcoRI和SamI雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)圖；
[0040] 圖中：Μ---DMmarker;1~4陽性克隆雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果；
[0041]圖 5 是PPAR丫-siRNAl測(cè)序及BLAST 結(jié)果；
[0042]圖 6 是PPAR丫 -siRNA2 測(cè)序及BLAST 結(jié)果；
[0043]圖 7 是PPAR丫-siRNA3 測(cè)序及BLAST結(jié)果；
[0044]圖 8 是PPAR丫 -siRNA4 測(cè)序及BLAST 結(jié)果；
[004引 圖9是各干擾載體對(duì)pPPAR丫mRNA表達(dá)的影響（沖<0. 05 ;*沖<0. 01);
[0046]圖 10 是pPPAR丫-siRNAl對(duì)pPPAR丫mRNA表達(dá)的影響圖（*沖<0. 01);
[0047]圖 11 是pPPAR丫-siRNAl對(duì)ATCL表達(dá)的影響圖（*沖<0. 01);
[0048] 圖12是pPPAR丫 -siRNAl對(duì)服L表達(dá)的影響圖（*沖<0. 01);
[0049] 圖13是RES和pPPAR丫 -siRNAl對(duì)pPPAR丫基因表達(dá)的影響圖（沖<0. 05 ; *沖<0. 01);
[0050] 圖14是RES和pPPAR丫 -siRNAl對(duì)pPPAR丫基因表達(dá)的影響圖（沖<0. 05 ; *沖<0. 01);
[0051]圖 15 是NAM和pPPAR丫-siRNAl對(duì)pPPAR丫 表達(dá)的影響圖（沖<0. 05 ;*沖<0. 01);
[0052]圖 16 是NAM和pPPAR丫-siRNAl對(duì)ATCL表達(dá)的影響圖（沖<0. 05 ;*沖<0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[00閲 （一）、pPPAR丫的SiRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
[0054] 1、祀序列選擇：根據(jù)pPPAR丫全長基因序列，遵循化schl規(guī)則和Cenix規(guī)則設(shè)計(jì) 并篩選pPPAR丫的siRNA祀序列：
[00巧]PPAR丫-siRNAl:5'-AACTTTGGGATCAGCTCTGTG-3'
[0056]PPAR丫-siRNA2 :5,-AACAAACCTCACGAAGAGCCT-3，
[0057]PPAR丫-siRNA3 :5,-AAAGTCCTTCCCGCTGACCAA-3'
[0058]PPA