一種促進(jìn)利福霉素sv發(fā)酵合成效率的補(bǔ)料方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促進(jìn)利福霉素SV發(fā)酵合成效率的補(bǔ)料方法。本發(fā)明屬于生物制藥發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別是涉及一種發(fā)酵過(guò)程調(diào)控胞內(nèi)NADH的氧化方向迀移及效率、改善碳、氮代謝流分配、促進(jìn)利福霉素SV的核心氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸的生成，提高利福霉素SV合成效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]做為結(jié)核病治療的大宗抗生素原料藥，提高利福霉素發(fā)酵合成效率一直備受生產(chǎn)企業(yè)和研究單位關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于提高利福霉素發(fā)酵效價(jià)的報(bào)道較多，包括:生產(chǎn)菌種的分子生物學(xué)信息特征、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化等方面，如對(duì)比文獻(xiàn)1:在搖瓶水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效價(jià)12.3% (食品與發(fā)酵工業(yè)，商純良，2011，37 (5):56-60);對(duì)比文獻(xiàn)2:在50噸大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV發(fā)酵十億提高5.4% (發(fā)明專利ZL201210176175.9);對(duì)比文獻(xiàn)3:添加丙氨酸、豆油和磷霉素鈉/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效價(jià)平均提高17.0% (發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210176177.8)。對(duì)比文獻(xiàn)4:在10L發(fā)酵罐培養(yǎng)地中海擬無(wú)枝酸菌過(guò)程中基料添加鋅離子(終濃度0.75mg/L)對(duì)利福霉素SV效價(jià)和有機(jī)酸合成產(chǎn)生了顯著影響(中國(guó)釀造，鄧鵬飛，2013，32 (8):84-87)。但是，對(duì)比文獻(xiàn)1只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在確定的優(yōu)化濃度下，利福霉素SV效價(jià)提高12.3%，并對(duì)生產(chǎn)菌種的糖酵解途徑碳代謝、有機(jī)酸合成效率以及效價(jià)合成的影響進(jìn)行了初步的分析，并沒有涉及發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化方向迀移和效率對(duì)利福霉素SV合成的影響；對(duì)比文獻(xiàn)2涉及豆油和乙二酸的雙重作用調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵步驟一琥珀酸脫氫酶催化的反應(yīng)的活性，通過(guò)促進(jìn)利福霉素SV前體一甲基丙二酰CoA的合成代謝效率來(lái)提高利福霉素SV的合成效率，也沒有涉及發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化方向迀移及效率對(duì)利福霉素SV合成的影響；對(duì)比文獻(xiàn)3僅初步說(shuō)明了三者具有調(diào)節(jié)利福霉素SV發(fā)酵的作用，而且該文獻(xiàn)也沒有涉及發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化方向迀移和效率對(duì)利福霉素SV合成的影響；對(duì)比文獻(xiàn)4通過(guò)分析胞外部分有機(jī)酸、氨基酸的變化規(guī)律，報(bào)道鋅離子通過(guò)抑制丙氨酸脫氫酶活性并引起丙酮酸積累，使由草酰乙酸衍生的賴氨酸和由α -酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大，促進(jìn)了利福霉素SV的合成。但是，對(duì)比文獻(xiàn)4并沒有涉及發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化方向迀移和效率對(duì)利福霉素SV合成的影響。
[0003]氧化還原反應(yīng)幾乎參與到微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，在有氧呼吸條件下，NADH經(jīng)電子傳遞鏈氧化為NAD+，并產(chǎn)生大量ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)和產(chǎn)物的合成提供能量。但在發(fā)酵條件下電子傳遞受到限制，并引起碳代謝途徑發(fā)生改變。細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中糖酵解途徑(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)會(huì)大量產(chǎn)生NADH，在發(fā)酵條件下細(xì)胞若不能很好的將NADH經(jīng)電子傳遞鏈或一些脫氫酶催化的反應(yīng)(如:丙氨酸脫氫酶)氧化，就會(huì)出現(xiàn)NADH/NAD+比例失衡。這必然會(huì)影響細(xì)胞的生理代謝和次級(jí)代謝物的積累。利福霉素SV的氮環(huán)前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成效率與谷氨酰胺合成酶(GS)的活力密切正相關(guān)并受丙氨酸(Ala)抑制，而發(fā)酵條件下細(xì)胞通過(guò)丙氨酸脫氫酶氧化NADH生成Ala，該途徑流量增強(qiáng)會(huì)抑制GS活性以及3-氨基-5-羥基苯甲酸的合成效率。因此，若能改變發(fā)酵條件下NADH的氧化方向以及效率，即:降低NADH經(jīng)丙氨酸脫氫酶催化途徑碳流量，則既能使發(fā)酵條件下NADH/NAD+處于失衡狀態(tài)，又能降低Ala的積累，使GS活性維持在較高水平，從而促進(jìn)3-氨基-5-羥基苯甲酸和利福霉素SV的合成效率。因此，發(fā)酵條件下選擇細(xì)胞合適的受氫體可能會(huì)實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0004]在前期研究和生產(chǎn)中，我們確定發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液中乙醇的濃度相當(dāng)高，而地中海擬無(wú)枝酸菌細(xì)胞是通過(guò)乙醇脫氫酶來(lái)氧化NADH并合成乙醇的，而受氫體為乙醛分子。在有機(jī)化工行業(yè)，乙醛是常用二碳試劑，也可構(gòu)建雜環(huán)環(huán)系；在食品行業(yè)可用于調(diào)配水果香精，也可用于釀造酒用香精，在加香食品中濃度約為3.9-270mg/kg。但是，沒有關(guān)于外源乙醛分子作為代謝調(diào)控因子作用于地中海擬無(wú)枝酸菌的新功能的報(bào)道，即:使NADH的氧化途徑由丙氨酸脫氫酶催化的反應(yīng)向乙醇脫氫酶催化方向迀移，并通過(guò)促進(jìn)乙醇脫氫酶的活性來(lái)增強(qiáng)NADH的氧化、降低丙氨酸的合成、調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化方向和效率、提高利福霉素SV氮環(huán)前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成效率、促進(jìn)利福霉素SV發(fā)酵產(chǎn)量的新功能的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)利福霉素SV發(fā)酵合成效率的新補(bǔ)料方法，其實(shí)質(zhì)性是不將乙醛作為常規(guī)意義上的有機(jī)化工二碳試劑、食品行業(yè)調(diào)配香精來(lái)使用，而是將乙醛分子作為代謝調(diào)控因子來(lái)促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中NADH的氧化迀移和效率、增強(qiáng)利福霉素SV氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸的合成效率、提高利福霉素SV的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0006]地中海擬無(wú)枝酸菌的三級(jí)發(fā)酵48_72h時(shí)，開始無(wú)菌流加乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前10h，使其終濃度為1.5-3.0mmol/L，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)利福霉素SV效價(jià)平均提高10.1%。
[0007]所述發(fā)明具有材料易購(gòu)、操作工藝簡(jiǎn)單、可控性高、適用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明提出的一種促進(jìn)利福霉素SV發(fā)酵合成效率的補(bǔ)料方法，包括以下步驟:
[0009](1)培養(yǎng)基的制備
[0010]①種子培養(yǎng)基
[0011]葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1.0%，蛋白胨1.0%，硝酸鉀0.05%，碳酸鈣0.2%，可溶性淀粉1.5%，pH 7.0。經(jīng)0.1MPa蒸氣滅菌30min備用；
[0012]②發(fā)酵培養(yǎng)基
[0013]葡萄糖6-10%，魚粉 0.3-0.55%，黃豆餅粉 0.5-0.65%，蛋白胨 0.4-0.7%，硝酸鉀0.6-0.8% ,碳酸I丐0.5% ,磷酸二氫鉀0.02%，pH自然。經(jīng)0.1MPa蒸氣滅菌20min
備用ο
[0014](2)菌種活化
[0015]取保藏的地中海擬無(wú)枝酸菌(A.mediterranei)菌種接入種子培養(yǎng)基，在搖床上培養(yǎng)48h，培養(yǎng)條件為28°C、220r/min。
[0016](3)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集
[0017]將上述菌種接到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為3% -5%，于27°C -28°CU50-200r/min振蕩培養(yǎng)46_50h，后無(wú)菌操作將搖瓶種子培養(yǎng)基合瓶。(4) 二級(jí)種子培養(yǎng)與三級(jí)發(fā)酵
[0018]將合瓶種子火焰保護(hù)接入二級(jí)種子罐，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速為160-200r/min，空氣流量控制為0.8vvm，罐壓控制為0.03-0.04MPa，培養(yǎng)48h后移種至三級(jí)發(fā)酵罐。
[0019](5)三級(jí)發(fā)酵罐控制
[0020]培養(yǎng)溫度28 °C，轉(zhuǎn)速 0-48h 為 200r/min，48_72h 為 220r/min，72_96h 為 230r/min，96h 至放耀為 240r/min?？諝饬髁靠刂?0_48h 為 0.4vvm，48_72h 為 0.6vvm，72_96h為 0.8vvm, 96h 至放罐為 lvvm0 罐壓控制:0_48h 為 0.02MPa，48_72h 為 0.03MPa，72_96h 為0.04MPa，96h 至放罐為 0.05MPa。
[0021](6)三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)周期為48_72h時(shí)，開始流加補(bǔ)入乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前10h，使其終濃度為1.5-3.0mmol/L，其它控制工藝不變。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步:按本技術(shù)方案進(jìn)行操作，將作為有機(jī)化工行業(yè)常用二碳試劑和食品行業(yè)調(diào)香劑的外源乙醛用作代謝調(diào)控因子作用于地中海擬無(wú)枝酸菌，調(diào)節(jié)了發(fā)酵過(guò)程N(yùn)ADH的氧化迀移和效率、使發(fā)酵中后期乳酸、琥珀酸、蘋果酸、丙氨酸的濃度降低，谷氨酸濃度大幅提高，更有效促進(jìn)了 3-氨基-5-羥基苯甲酸的合成，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)利福霉素SV效價(jià)平均提高10.1%。這是與現(xiàn)有技術(shù)最明顯的不同，超出了對(duì)利福霉素SV促進(jìn)效果的預(yù)期，產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
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