Khdc1l基因作為疾病診斷標(biāo)志物的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及人KHDC1L基因在骨關(guān)節(jié)炎的診斷、治療中 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國已逐步跨入了老齡化社會(huì)，0A對(duì)人體健康的影響程度W及所造成的醫(yī)療費(fèi)用 正在W驚人的速度逐年增長。有資料顯示，60歲W上的人口中50%的人群在X線片上有0A 的表現(xiàn)，其中35 %~50 %有臨床癥狀，在75歲W上的人群中80%W上有0A的癥狀，運(yùn)是一 個(gè)非?？膳碌谋壤，F(xiàn)在，0A已經(jīng)成為僅次于屯、臟病使患者喪失工作能力的第二位主要疾 病，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，從而引起國內(nèi)外專業(yè)人±的廣泛關(guān)注。
[0003] 目前，骨關(guān)節(jié)炎診治指南中關(guān)于0A的定義如下：0A指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖 維化、薇裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疾病。病因尚不明確，其發(fā)生與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷 及遺傳因素等有關(guān)。其病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨變性破壞、軟骨下骨硬化或囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨 質(zhì)增生、滑膜增生、關(guān)節(jié)囊李縮、初帶松弛或李縮、肌肉萎縮無力等。W中老年患者多見，女 性多于男性。該病的致殘率可高達(dá)53%。0A好發(fā)于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)，如膝、脊柱（頸 椎和腰椎）、髓、踩、手等關(guān)節(jié)，與遺傳和體質(zhì)因素有一定的關(guān)系。
[0004] 0A初期階段是沒有明顯癥狀的，可能只是伴隨著間歇性的關(guān)節(jié)疼痛及壓痛或者關(guān) 節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)無力、活動(dòng)障礙等現(xiàn)象，很多人抱著饒幸屯、理，認(rèn)為既然沒有影響到日常生活， 就算不上大病。但是隨著病情發(fā)展嚴(yán)重后果而導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失的時(shí)候，就很可能致殘。對(duì) 此，臨床上一直的主張都是早診斷、早預(yù)防、早治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于骨關(guān)節(jié)炎 (Osterart虹itis，0A)早期診斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎的診斷方法，使用基 因標(biāo)志物來診斷骨關(guān)節(jié)炎的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知 曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測KHDC1L基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具中的應(yīng) 用。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測KHDC1L基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測KHDC1L基因mRNA水平的產(chǎn) 品、和/或檢測KHDC1L蛋白水平的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測KHDC1L基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫 檢測、原位雜交或忍片檢測KHDC1L基因表達(dá)W診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。
[0010] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增KHDC1L基因 的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增KHDC1L基因的引 物；所述用免疫檢測診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與KHDC1L蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用 原位雜交診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與KHDCIL基因的核酸序列雜交的探針；所述用忍片診 斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與KHDC1L蛋白特異性 結(jié)合的抗體，基因忍片包括與KHDC1L基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增KHDC1L基因 的引物如沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4所示。
[0012] 所述檢測KHDCIL基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測KHDCIL基因表達(dá)的試劑、也可W是 包含所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測序平臺(tái)。
[0013] 所述診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺(tái)； 高通量測序平臺(tái)是一種特殊的診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè) 人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá) 譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知KHDC1L基因的異 常與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)也屬于KHDC1L基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具，所述工具包括檢測KHDC1L基因表達(dá) 的試劑；所述試劑包括檢測KHDC1L基因mRNA的引物和/或探針、檢測KHDC1L蛋白的抗體。
[0015] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺(tái)。
[0016] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片；所述基因忍片包括固相載體W及固 定在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測KHDC1L基因轉(zhuǎn)錄水平的 針對(duì)KHDC1L基因的寡核巧酸探針；所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的 KHDC1L蛋白的特異性抗體；所述基因忍片可用于檢測包括KHDC1L基因在內(nèi)的多個(gè)基因 (例如，與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括KHDC1L 蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與 骨關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物同時(shí)檢測，可大大提高骨關(guān)節(jié)炎診斷的準(zhǔn)確率。
[0017] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測KHDC1L基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括KHDC1L蛋 白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測、原位雜交或 忍片方法檢測KHDC1L基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)KHDC1L 基因的引物和/或探針。根據(jù)KHDC1L基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可W用于檢測 KHDC1L基因表達(dá)水平的引物和探針。
[001引所述試紙包括檢測KHDC1L基因表達(dá)的試劑。
[0019] 所述高通量測序平臺(tái)包括檢測KHDC1L基因表達(dá)的試劑。
[0020] 與KHDC1L基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或 其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié) 合，任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長度W15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0021] 進(jìn)一步，所述KHDC1L蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 KHDC1L蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗 體、scFv、F油、F(油'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與KHDCIL蛋白的結(jié)合能力即可。用 于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制 備所述抗體。 陽02引在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測KHDC1L基因mRNA的引物包括SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4所示的引物對(duì)。
[0023] 本發(fā)明還提供了KHDCIL基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的 藥物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制KHDC1L基因表達(dá)的試劑、和/或抑制KHDC1L基因表 達(dá)產(chǎn)物的試劑。
[0024] 進(jìn)一步，所述抑制KHDCIL基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻 譯的試劑；所述抑制KHDCIL基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制KHDCIL基因mRNA的試劑、抑制 KHDCIL蛋白的試劑。所述抑制KHDCIL基因mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制 mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制KHDCIL蛋白的試劑包括抑制KHDCIL蛋白穩(wěn)定性的試劑、 抑制KHDCIL蛋白活性的試劑、抑制KHDCIL蛋白功能的試劑。 陽0巧]進(jìn)一步，抑制KHDCIL基因mRNA的試劑包括針對(duì)KHDCIL基因mRNA的雙鏈核糖核 酸；抑制KHDCIL蛋白功能的試劑包括KHDCIL抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制KHDCIL蛋白功能 的抗體。所述抗體可W是多克隆抗體，或是單克隆抗體。 W26] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)KHDCIL基因mRNA的雙鏈核糖核酸 是siRNA。為了確保KHDCIL基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)KHDCIL基因的mRNA序 列設(shè)計(jì)了siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則巧化ashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，趾vor