對親水氣單胞菌o29，o30，o33和o35特異的核苷酸及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對親水氣單胞菌029, 030, 033和035血清型特異的核巧酸，尤其設(shè)及 對親水氣單胞菌029,030,033和035血清型0抗原基因簇中單個基因特異的核巧酸及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】 親水氣單胞菌（Aeromonashy化ophila)屬于弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿 菌，沒有芽抱和芙膜，又名嗜水氣單抱菌。親水氣單胞菌廣泛存在于自然界眾多水體中，是 多種水生動物的原發(fā)性致病菌。為條件性致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。它 通過腸道進(jìn)入機體，可W產(chǎn)生毒性很強的外毒素，引起暴發(fā)性出血病。一般情況下，菌體對 腸道組織的粘附力越強，其產(chǎn)生的外毒素的毒性就越強。親水氣單胞菌的血清型很多，癥狀 也各異，由親水氣單胞菌感染的疾病一般病情嚴(yán)重，多位惡性傳播，死亡率較高。
[0002] 細(xì)菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學(xué)方法W及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型運 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，不 同的0抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清 鑒定方法成為發(fā)展方向。
[0003] 親水氣單胞菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為親水氣單胞菌菌種與株型 鑒定的重要依據(jù)，不少新菌也因此產(chǎn)生。對弧菌而言，生化反應(yīng)主要是各種酶譜的表現(xiàn)，屬 于外部形態(tài)的內(nèi)容，核酸的相似性才是弧菌種的界定最根本、最直接的特征。因此，親水氣 單胞菌的分型與鑒定最有效、最直接的方式應(yīng)該從核酸的研究觸發(fā)，通過比較核酸(包括基 因組與核酸片段）的相似性確定親水氣單胞菌的歸屬。
[0004] 近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)ατ巧序列分析、隨機擴增長度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態(tài)性（RFL巧分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于親水氣單胞菌的快速血清分型篩查， 穩(wěn)定的鑒定結(jié)果可W彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，運些基于多聚 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的分子檢測技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快 速、靈敏、特異性強等優(yōu)點。
[0005]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術(shù)）作為微生物 檢測技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離屯、及裂解制備 細(xì)菌DNA模板，就可W在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需1個半小時。運對檢驗檢疫部 口和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0006] 不論從國內(nèi)和國際的角度來看，快速、準(zhǔn)確地鑒定出血清類型，為親水氣單胞菌的 防控提供有效技術(shù)支持是十分重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了一種對親水氣單胞菌0抗原特異的核巧酸，其特征在于 所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種； 2) 與SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸互補的核巧酸中的至少一種；所述的SEQIDNO: 1-8 如下：
本發(fā)明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DM聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDN0:l-8所示的核巧酸中的至少一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mldNTP30μ1 ; 10X酶特異性反應(yīng)緩沖液50μ1 ;5U/μ1耐熱DNA聚合酶5μ1 ;引物混合 物10μ1 ;陽性對照品10μ1 ;陰性對照品10μ1 ;d地2〇 5ml。
[000引其中所述的PCR引物優(yōu)選為所述如SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種對親水氣單胞菌0抗原特異的SEQIDN0:l-8核巧酸在 制備用于檢測親水氣單胞菌0抗原PCR試劑盒、基因忍片或微陣列方面的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所述親水氣單胞可W取樣于自來水、污水、海水的培養(yǎng)物的粗提液、瓜果蔬 菜中、病體標(biāo)本或是親水氣單胞菌的純培養(yǎng)物的粗提液。
[0011] 收集親水氣單胞菌提取基因組是采用常規(guī)方法制備獲得。
[0012] 針對親水氣單胞菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預(yù)處理一擴增一電泳檢 測結(jié)果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴增管中，使用者只需將預(yù)處理后 的樣本加入擴增管啟動擴增反應(yīng)即可，簡單快速的完成檢測工作。
[0013] 本發(fā)明還提供一種基因忍片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核巧酸探 針，其中所述寡核巧酸探針包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優(yōu)選為如SEQIDNO: 1-8所 示的核巧酸。
[0014] 本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優(yōu)選為如SEQ IDNO: 1-8所示的核巧酸。檢測親水氣單胞的基因忍片方面、檢親水氣單胞微陣列方面的應(yīng) 用。所述親水氣單胞菌是檢測由于污染水源和未煮熟、未清洗的食物引起的急性胃腸炎、外 傷感染、腸道傳染病、醫(yī)院內(nèi)感染等多種混合型感染的細(xì)菌。
[0015] 本發(fā)明公開的一種對親水氣單胞菌0抗原特異的核巧酸與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明 具有如下優(yōu)點： (1)實用性強：本發(fā)明建立的一種PCR反應(yīng)體系，可檢測親水氣單胞菌，提供血清分型 檢測所用到的特異引物，利用該PCR方法可W對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。
[0016] (2)準(zhǔn)確性高：本發(fā)明通過對親水氣單胞菌的各血清型特異的基因的PCR反應(yīng)，每 個樣品得到一條目的條帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可W得到親水氣單胞菌 所屬的血清型。
[0017] (3)檢測成本相對較低：可W推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、尚品監(jiān)測檢驗 檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術(shù)模式。
[0018]W上所述，僅是本發(fā)明的操作和實施方法而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限 審IJ，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對W上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍 屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
[001引
【附圖說明】： 圖1表示本發(fā)明029血清型特異引物檢測親水氣單胞菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果 圖，WZX基因P1和P2引物的篩選，目的條帶為16化P，其余的血清型沒有任何條帶具體菌株 信息見表2 ; 圖2表示本發(fā)明029血清型特異引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢測了 6株弧 菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發(fā)明030血清型WZX基因P3和P4引物檢測親水氣單胞菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn) 菌株電泳結(jié)果圖，WZX基因P3和P4引物的篩選，目的條帶為2nbp，其余的血清型沒有任何 條帶。具體菌株信息見表2; 圖4表示本發(fā)明030血清型WZX基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表2 ; 圖5表示本發(fā)明033血清型基因P5和P6引物檢測親水氣單胞菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn) 菌株電泳結(jié)果圖，wz/?基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為198bp，其余的血清型沒有任何 條帶，具體菌株信息見表2; 圖6表示本發(fā)明033血清型wzm基因P5和P6引物種特異性的鑒定；電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖7表示本發(fā)明035血清型wzy基因P7和P8引物檢測親水氣單胞菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn) 菌株電泳結(jié)果圖，GT基因P7和P8引物的篩選，目的條帶為189bp，其余的血清型沒有任何 條帶。具體菌株信息見表2; 圖8表示本發(fā)明035血清型wzy基因P7和P8引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表2 ; 圖9表示分別用029, 030, 033和035特異引物擴增對應(yīng)血清型的電泳結(jié)果圖，具體菌 株信息見表2 ; 其中029、030、033、035、和負(fù)對照（-)表示相應(yīng)血清型引物擴增結(jié)果，第一個泳道H和 最后一個泳道是 2000bpladdermarker。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解運些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ewYork:ColdSpringHarbor L油oratoryPress, 1989)中所述的條件。其中親水氣單胞菌來源于JapanCollectionof Microorganisms(JCM)。
[0021] 連施例1:基閑紀(jì)的提取 37°C營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)親水氣單胞菌，收集細(xì)菌，提取基因組具體步驟如下： 用500ul50mMTris-肥l(p冊.0)和lOul0. 4M邸TA重懸細(xì)胞，37°C溫育20分鐘，然 后加入lOullOmg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3ullOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酪 抽提混合物，取上清液，再用等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清 液，再用等體積的乙酸抽提W除去殘余的酪。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中?；蚪MDNA通過0. 4%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
[00過連施例2:序列破譯 提取親水氣單胞菌各個血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組，通過Solexapair-end測序技術(shù) 對親水氣單胞菌各個血清型基因組進(jìn)行全基因組測序獲得該血清型的序列，運用Blast 及PSI-Blast進(jìn)行序列比對，采用TMHMM2. 0program進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，運用ClustalW program進(jìn)行序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得親水氣單胞菌各個血清型的 0抗原基因簇序列及破譯結(jié)果。
[0023]連施例3:引物巧計 親水氣單胞菌各個血清型的0抗原基因簇序列是本實驗室自測的，通過比對分析，我 們選取Blast比對結(jié)果identity和similarity值相對較低的基因特異區(qū)段設(shè)計引物。其 中029血清型的