基于二代測(cè)序平臺(tái)的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒，尤其是設(shè)及一種基于二代測(cè) 序平臺(tái)對(duì)結(jié)腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國(guó)高居各類(lèi)癌癥發(fā)病率的第3位，占癌癥死因的第5位， 其根治性切除后5年生存率為50%左右，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的重要原因。早期 結(jié)腸癌患者通常可借手術(shù)切除，一旦轉(zhuǎn)移，其治療的方法并不多，患者五年生存率也不理 想。研究發(fā)現(xiàn)，基因組的不穩(wěn)定性與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，基因組的不穩(wěn)定性包 括染色體不穩(wěn)定性（C虹omosomalinst油ility，CI)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI)。
[0003] 微衛(wèi)星是指基因上含有重復(fù)的DM短小序列或單核巧酸區(qū)域。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng) DNA發(fā)生甲基化或基因突變致錯(cuò)配修復(fù)基因缺失時(shí)，可導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)序列錯(cuò)配（微衛(wèi)星 突變），導(dǎo)致其序列縮短或延長(zhǎng)，從而引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatelliteinst油ility， MSI)。根據(jù)MSI不穩(wěn)定性的程度，可分為高不穩(wěn)定性（MSI-H)和低不穩(wěn)定性（MSI-L)，正常 情況下稱(chēng)為微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellitest油ility，MS巧。
[0004] 大量研究表明，MSI參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與結(jié)腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等 等發(fā)生密切相關(guān)。約15%的結(jié)直腸癌患者存在MSI現(xiàn)象，其中典型的遺傳性非息肉病性結(jié) 直腸癌化ereditary no噸olyposis colerectal cancer, HNPCC)患者90%W上為MSI瘤， 表明MSI可作為檢測(cè)是否為HNPCC患者的重要標(biāo)志物；與MSS(即微衛(wèi)星穩(wěn)定）的結(jié)腸癌相 比，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌患者其預(yù)后更好，并且二者藥物反應(yīng)也不一樣，提示MSI可作為 結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因此，MSI檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者意義重大。
[0005] 美國(guó)國(guó)家腫瘤研究所（化tionalCancerInstitute,NCI)曾經(jīng)通過(guò)一個(gè)針對(duì)腫 瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定及復(fù)制錯(cuò)誤表型檢測(cè)的國(guó)際專(zhuān)題會(huì)議制定了MSI檢測(cè)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)（即 BethesdaGuidelines)，作為設(shè)及檢測(cè)MSI的參考Panel(即NCIPanel)，它包含2個(gè)單核 巧酸重復(fù)的位點(diǎn)度AT-25、BAT-26)和3個(gè)2核巧酸重復(fù)的位點(diǎn)值2S123、D5S346、D17S250)。 據(jù)此對(duì)腫瘤MSI狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，5個(gè)STR位點(diǎn)如果檢測(cè)出2個(gè)或2個(gè)W上的位點(diǎn)有MSI, 則為MSI-H，MSI-H腫瘤表現(xiàn)出特有的臨床及病理學(xué)表型；若只檢測(cè)出1個(gè)位點(diǎn)有MSI,則為 MSI-L無(wú)任何位點(diǎn)變化者為MSS。然而，MSI-L與MSS的腫瘤表型差異不大，要區(qū)別MSI-L 與MSS的腫瘤表型，需要選用更多位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)才能實(shí)現(xiàn)。
[0006] 在2002年的第二次相關(guān)專(zhuān)題會(huì)議上，針對(duì)之前采納的檢測(cè)MSI的參考Panel來(lái)檢 巧。MSI出現(xiàn)了爭(zhēng)議，因?yàn)镹CIPanel使用的3個(gè)2核巧酸重復(fù)的位點(diǎn)具有高多態(tài)性的特征， 在檢測(cè)時(shí)必須用與腫瘤組織相匹配的正常組織來(lái)作比較才能得出結(jié)果，使其在檢測(cè)存在錯(cuò) 配修復(fù)缺陷的腫瘤時(shí)表現(xiàn)出較低的特異性和靈敏度。因此采用NCIPanel來(lái)檢測(cè)MSI存在 一定的局限性，大會(huì)建議增加單核巧酸重復(fù)位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)MSIW提高檢測(cè)的靈敏度。
[0007] 2015年最新發(fā)布的藥物代謝酶和藥物作用祀點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南（試行）中 明確規(guī)定，MSI的檢測(cè)可用于氣尿喀晚類(lèi)藥物的輔助療效預(yù)測(cè)。近期研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H較MSI-L和MSS的結(jié)腸癌患者在接受PD-1抗體〔即抑A批準(zhǔn)的兩種免疫檢查點(diǎn)抑制藥物 (Nivolumab(MDX1106)和化mbrolizum油））治療后具有更好的臨床反應(yīng)性，表明結(jié)直腸癌 患者的MSI水平可作為一個(gè)對(duì)PD-1/PD-L1抗體響應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子來(lái)預(yù)測(cè)篩選從PD-1抗 體免疫治療獲益的結(jié)腸癌患者群體。對(duì)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的MSI水平，可用于免疫檢查點(diǎn) 抑制劑類(lèi)藥物的輔助療效預(yù)測(cè)。
[0008] 因此，建立MSI檢測(cè)體系W尋找高度靈敏性及特異性的用來(lái)檢測(cè)MSI的相關(guān)位點(diǎn) 已成為近年來(lái)研究MSI檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0009] 現(xiàn)有檢測(cè)MSI的方法主要為：
[0010]1)免疫組化方法，該方法僅用于腫瘤細(xì)胞中的MLH1、Μ甜2、MS冊(cè)和PMS2蛋白結(jié)合， 如果沒(méi)有結(jié)合任何的蛋白，則證明發(fā)生了MSI;該方法的靈敏度雖然接近90%，但特異性和 可重復(fù)性較低，操作比較復(fù)雜；
[0011] 2)毛細(xì)管電泳法，該方法主要針對(duì)MSI相關(guān)的基因序列上簡(jiǎn)單的重復(fù)結(jié)構(gòu)，通過(guò) 片段分析可W判斷重復(fù)堿基的重復(fù)數(shù)目，從而進(jìn)行MSI基因分型；該方法使用相對(duì)成熟，進(jìn) 樣量少、分辨率和自動(dòng)化程度較高，然而由于進(jìn)樣量少，因而制備能力差；而毛細(xì)管直徑小 導(dǎo)致光路太短，用一些檢測(cè)方法（如紫外吸收光譜法）時(shí)，靈敏度較低；此外，電滲會(huì)因樣品 組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性；
[0012] 3)PCR法，該方法通過(guò)選定特異的引物，W自身正常組織為對(duì)照，在體外對(duì)微衛(wèi)星 位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影等分析有無(wú)遷移 率的改變；該方法是目前常用的檢測(cè)方法且已經(jīng)被證實(shí)為最有效的初篩手段，但PCR法只 檢測(cè)五個(gè)微衛(wèi)星基因，產(chǎn)物做凝膠電泳的方法，存在操作繁瑣、成本高等諸多缺陷；
[0013] 4)多重巧光PCR，該方法主要針對(duì)NCI建議的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，W確定MSI狀態(tài)；采 用該方法檢測(cè)微衛(wèi)星，其引物間的競(jìng)爭(zhēng)與干擾因素較為復(fù)雜，擴(kuò)增產(chǎn)物不容易錯(cuò)開(kāi)，會(huì)直接 導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不確定性，因此該方法對(duì)引物特異性和引物濃度都有很高的要求；
[0014]W直接測(cè)序法，該方法針對(duì)MMR基因各區(qū)域（MLH1、Μ甜2、MS冊(cè)和PMS2等）的擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行sanger法測(cè)序來(lái)確定其MSI狀態(tài)；該方法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，成本相對(duì)較高。
[0015] 因此急需開(kāi)發(fā)更多位點(diǎn)和更好靈敏度的MSI檢測(cè)系統(tǒng)勢(shì)W滿足市場(chǎng)和醫(yī)療的迫 切需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于二代測(cè)序平臺(tái) 的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒，使用該試劑盒對(duì)結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)通量高，靈敏度強(qiáng)，特異性強(qiáng)，能夠一次性檢測(cè)所有位點(diǎn)。
[0017] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，基于二代測(cè)序平臺(tái)的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不 穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒，包括4. 5 - 6. 5μ1 (優(yōu)選5μ1)的引物panel溶液，所述引物panel溶 液中各溶質(zhì)的濃度均為45 - 55mmol/L(優(yōu)選50mmol/L)。
[001引所述引物panel包括10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，其正向引物與反向引物序列如下：
[0019]
[0020] 所述試劑盒中，還包括8 - 10μ1 (優(yōu)選9. 5μ1)的MasterMixW及1. 3 - 1. 7血（優(yōu)選1. 5血）無(wú)酶水；
[0021] 所述MasterMix包括 3 ~7μ1 (優(yōu)選 5μ1) 10禮ATaqBuffer和 3 ~5μ1 (優(yōu) 選 4μ]_) 2 ~4mmol/L的dNTPs，W及 0. 5 ~1μ1LATaqenzyme。
[0022] 所述基于二代測(cè)序平臺(tái)的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒的多重PCR反應(yīng)條 件為：93°C~98°C預(yù)變性2~3min，然后進(jìn)入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段：93°C~96°C變性 20~30s，55°C~65°C退火20~30s，70°C~75°C延伸20~45s;最后70°C~74°C延伸 lOmin，并進(jìn)行10~12個(gè)循環(huán)，4°C靜置。
[0023] 多重PCR過(guò)程同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，所用對(duì)照樣本為正常人基因組DNA。
[0024] 所述的基于二代測(cè)序平臺(tái)的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)基因包括 NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27,D2S123,D5S346 和D17S250。
[00巧]二代測(cè)序反應(yīng)體系的組成為：DNA樣本多重PCR反應(yīng)、模板文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)模板準(zhǔn) 備和富集反應(yīng)、上機(jī)測(cè)序反應(yīng)和測(cè)試數(shù)據(jù)處理分析。
[0026] 本發(fā)明之基于Illumina公司的MiSeq二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)結(jié)腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定 性的檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括進(jìn)行MSI相關(guān)的10個(gè)標(biāo)記基因的多重PCR反應(yīng)、模板文 庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序W及基于測(cè)序結(jié)果對(duì)微衛(wèi)星狀態(tài)的結(jié)果判定。具體內(nèi)容如下：
[0027] (1)挑選MSI相關(guān)的10個(gè)標(biāo)記基因并進(jìn)行多重PCR反應(yīng)：
[0028] ①根據(jù)Besthesta guideline,調(diào)取敏感性和特異性最好的10個(gè)MSI標(biāo)記基因位 點(diǎn)序列（其中包括7個(gè)單核巧酸重復(fù)位點(diǎn)和3個(gè)雙核巧酸重復(fù)位點(diǎn)），見(jiàn)表1 :
[0029] 表1 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息
[0030]
[0031] 表2微衛(wèi)星位點(diǎn)測(cè)序引物
[0032]
[0033] ②對(duì)運(yùn)10個(gè)MSI相關(guān)的基因位點(diǎn)通過(guò)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述的擴(kuò) 增引物見(jiàn)表2。
[0034] 似進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序反應(yīng)
[0035] 模板文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程包括DNA隨機(jī)打斷、末端補(bǔ)平修復(fù)及純化、末端連接測(cè)序接頭、 模板擴(kuò)增和純化、純化后富集，所述反應(yīng)體系中包含末端補(bǔ)平酶混合物20μ1、0. 4-1U連 接酶、0. 4-lU擴(kuò)增Taq酶、5-lOmM測(cè)序接頭A和Pl、5-10mM測(cè)序接頭A和PI通用引物、 10-15XBuffer和2-5XAmpure純化磁珠等試劑。
[0036] 上述測(cè)序反應(yīng)包括MiSeq測(cè)序反應(yīng)過(guò)程，其原理是采用可逆性末端邊合成邊測(cè) 序反應(yīng)，首先在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構(gòu)建文庫(kù)，文庫(kù)加載到測(cè)序忍片 Flowcell上，文庫(kù)兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補(bǔ)，每條文庫(kù)片段都 經(jīng)過(guò)橋式PCR擴(kuò)增形成一個(gè)簇，測(cè)序時(shí)采用邊合成邊測(cè)序反應(yīng)，即在堿基延伸過(guò)程中，每個(gè) 循環(huán)反應(yīng)只能延伸一個(gè)正確互補(bǔ)的堿基，根據(jù)四種不同的巧光信號(hào)確認(rèn)堿基種類(lèi)，保證最 終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后，完整讀取核酸序列。上機(jī)反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果通過(guò)序 列篩選、拼接和比對(duì)等方法W及生物信息學(xué)分析，最終獲得測(cè)試樣本的SNP位點(diǎn)信息。
[0037] 本發(fā)明采用二代測(cè)序技術(shù)來(lái)檢測(cè)MSI基因位點(diǎn)，即，首先進(jìn)行MSI相關(guān)的10個(gè)標(biāo) 記基因的多重PCR反應(yīng)，接著構(gòu)建模板文庫(kù)、通過(guò)一系列上機(jī)模板準(zhǔn)備和富集反應(yīng)后獲得 測(cè)序文庫(kù)，然后基于Illumina公司的MiSeq二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)含MSI相關(guān)標(biāo)記基因位點(diǎn)進(jìn)行 測(cè)序，能夠一次性獲得所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異信息，檢測(cè)結(jié)果具有通量高，靈敏度強(qiáng)、特異 性好等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)種方法隨著試劑盒開(kāi)發(fā)成功可W批量生產(chǎn)，使用條件可W模式化，全部過(guò)程 都有自動(dòng)化設(shè)備。此外，用此試劑盒檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的MSI水平后，還可應(yīng)用于篩選適合 PD-L1抗體治療的結(jié)直腸癌患者人群。
[0038] 本發(fā)明之基于Illumina公司的MiSeq二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)國(guó)內(nèi)外發(fā)病率較高的結(jié) 腸癌患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性位點(diǎn)（包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、 M0N0-27,D2S123,D5S346和D17S250)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒能夠一次性檢測(cè)所有 MSI位點(diǎn)，其結(jié)果比5位點(diǎn)檢測(cè)更為準(zhǔn)確，特異性更好，人為干擾因素小，運(yùn)種方法隨著試劑 盒開(kāi)發(fā)成功可W批量生產(chǎn)，使用條件可W模式化，全部過(guò)程都有自動(dòng)化設(shè)備，能大大提高腫 瘤相關(guān)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè)水平。此外，用此試劑盒檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的MSI水平后， 還可應(yīng)用于篩選適合PD-L1抗體治療的結(jié)直腸癌患者人群。
[0039