雙重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測鴨甲肝病毒的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種可同時檢測1型和3型鴨甲肝病毒 的特異性雙重巧光定量RT-PCR(rRT-PCR)試劑盒、引物對、探針及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種重要傳染病，其主要致病因子是小RNA病毒， 即小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲型肝炎病毒（化ckh巧atitisAvi;rus，DHAV)。根據(jù) 全基因組序列分析，鴨甲型肝炎病毒可分為3個獨立的基因型，基因A型鴨甲型肝炎病毒 值HAV-A)、基因B型鴨甲型肝炎病毒值HAV-B)和基因C型鴨甲型肝炎病毒值HAV-C);根據(jù) 血清學(xué)中和實驗，運3個基因型無血清交叉，故分別對應(yīng)3個不同的血清型，血清1型鴨甲 肝病毒值HAV-1)、血清2型鴨甲肝病毒值HAV-2)和血清3型鴨甲肝病毒值HAV-3)。其中， DHAV-A代表傳統(tǒng)的流行毒株，全國范圍內(nèi)廣泛流行，也是我國鴨甲肝病毒的主要流行毒株， DHAV-B代表臺灣新型病毒株，DHAV-C代表近年來我國和韓國等國家和地區(qū)新出現(xiàn)的流行 毒株。由于3個基因型病毒所引起的疾病在臨床癥狀、病理變化上較為相似，給鑒別帶來很 大困難，而大陸主要流行DHAV-1型和DHAV-3型，所W對于DHAV-1和DHAV-3的快速準(zhǔn)確檢 測對于鴨病毒性肝炎的預(yù)防與控制具有重要意義。
[000引 目前關(guān)于DHAV的檢測方法，國內(nèi)外報道較多的包括血清中和試驗、瓊脂擴散試驗 和化ISA等，運些傳統(tǒng)檢測方法存在耗時長、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點，在實際應(yīng)用 中具有一定的局限性，在臨床上常常因為不能對其及時做出正確的診斷和有效防制而造成 巨大的經(jīng)濟損失。而實時巧光定量RT-PCR技術(shù)憑借其操作簡單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異 性強、重復(fù)性好及病原定量等優(yōu)勢，近年來在動物疫病檢測中得W廣泛應(yīng)用。因此建立和優(yōu) 化巧光定量RT-PCR方法，不僅為確定鴨病毒性肝炎致病因素提供了一種鑒別檢測方法，同 時也為DHAV-1和DHAV-3的流行病學(xué)調(diào)查提供了一種重要技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種敏感性好、特異性高、準(zhǔn)確可靠、快速簡便 的檢測血清1型和3型鴨甲型肝炎病毒的一步法雙重巧光定量RT-PCR試劑盒及方法，所 述方法利用化qMan探針技術(shù)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)DHAV-1與DHAV-3的同管同步鑒別，還能對 DHAV-1和DHAV-3的核酸進行準(zhǔn)確定量檢測。
[0005] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[000引 1、雙重化qMan巧光定量RT-PCR檢測1型和3型鴨甲肝病毒的引物對、探針，所述 引物對/探針包括檢測1型鴨甲肝病毒VP0基因和3型鴨甲肝病毒VP3基因的引物對/探 針；其中，引物對3和探針1用于檢測1型鴨甲肝病毒VP0基因，引物對4和探針2用于檢 測3型鴨甲肝病毒VP3基因；引物對3核巧酸序列如SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8所示， 探針1核巧酸序列如SEQIDNO. 9所示；引物對4核巧酸序列如SEQIDNO. 10和SEQID NO. 11所示，探針2核巧酸序列如SEQIDNO. 12所示。
[0007] 2、含有上述引物對、探針的試劑盒。
[000引優(yōu)選的，所述試劑盒由W下成分組成：
[0009]A液PCR擴增緩沖液（2XonestepRT-PCRBufferIII，RTEnzymeMixII，EXTaq 服DM聚合酶），20pmol/yL的引物對3,20pmol/yL的引物對4，10pmol/yL的探針1， lOpmol/yL的探針 2 ;
[0010]B液DHAV-1和DHAV-3RNA模板，作為陽性對照；
[0011] C液RNase化ee Water,作為反應(yīng)體系調(diào)整的基礎(chǔ)補充液及空白對照。
[0012] 3、利用所述試劑盒檢測1型和3型鴨甲肝病毒的方法，包括如下步驟：
[0013] 提取樣品RNA后，對樣品RNA進行巧光定量RT-PCR檢測，巧光定量RT-PCR反應(yīng)體 系如下：依次加入A液（2Xonest巧RT-PCRBufferllllOyLRTEnzymeMixII0. EXTaq服DM聚合酶0. 4μL，20pmol/μL的引物對3和4各0. 8μL，lOpmol/μL的探針 1 和 2 各 0. 8μL)，B液 4μL(DHAV-1 和DHAV-3RNA模板各 2μL)，最后用C液（RNaseFree Water)補至20化；擴增參數(shù)為：42°C反轉(zhuǎn)錄5min，95°C變性10s;95°C變性5s，54°C退火 15s，進行45個循環(huán)；擴增過程中選擇肥X和FAM雙重巧光通道，并在每個循環(huán)末收集巧光 信號；
[0014] 通過FQ-PCR儀自帶軟件自動分析讀取巧光定量RT-PCR檢測結(jié)果：選擇肥X巧光 通道，若出現(xiàn)Ct<35且呈對數(shù)增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中含1型鴨甲肝病毒，若 未出現(xiàn)Ct<35且呈對數(shù)增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中不含1型鴨甲肝病毒；選擇 FAM通道，若出現(xiàn)Ct<35且呈對數(shù)增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中含3型鴨甲肝病毒， 若未出現(xiàn)Ct<35且呈對數(shù)增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中不含3型鴨甲肝病毒。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：基于對DHAV-1和DHAV-3同時進行檢測和診斷的目的，本 發(fā)明研究篩選了兩套特異性的探針和引物，并通過進行不同的濃度配比，獲得最佳引物和 探針的濃度組合，據(jù)此建立了DHAV-1和DHAV-3的一步法雙重巧光定量RT-PCR檢測方法， 并制備了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0016] (1)測時短，操作方便簡潔；應(yīng)用本發(fā)明可實現(xiàn)一管同步二檢的目的，并且反轉(zhuǎn)錄 和PCR在一個反應(yīng)管中一步完成，整個過程僅需約50分鐘，且檢測結(jié)果可在電腦上直接讀 取；而常規(guī)RT-PCR步驟繁瑣耗時長，約需5小時；
[0017] 似檢測特異性好，靈敏度高；當(dāng)DHAV-1與DHAV-3同時存在時，獲得的Ct值與單 種病毒檢測的Ct值比較，結(jié)果基本一樣，說明兩種類型病毒的檢測結(jié)果間互不影響；另外， 本發(fā)明還可對樣品中相應(yīng)病原含量進行定量，并且靈敏度高，分別能檢測98拷貝DHAV-1和 10拷貝DHAV-3,比常規(guī)PCR方法靈敏度高約100倍，因而可用于DHAV-1和DHAV-3致病機 理及DHAV-1疫苗評估等方面的研究。
【附圖說明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[001引圖1DHAV-1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴增效率為98. 0%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2= 0. 999， 公式：Y= -3. 371X+42. 679,表明誤差小，可信度高。
[0020] 圖2DHAV-3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴增效率為96. 9%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2= 0. 998， 公式：Υ= -3. 398X+42. 858,表明誤差小，可信度高。
[0021] 圖3巧光定量RT-PCR檢測DHAV-1的敏感性試驗結(jié)果，曲線1~4分別為10倍梯 度倍比稀釋至濃度為4. 88X104~4. 88X10icopies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線，根據(jù)擴增曲線 可看出該方法最低檢測限度為49copies/μL。
[002引圖4巧光定量RT-PCR檢測DHAV-3的敏感性試驗結(jié)果，曲線1~4分別為10倍梯 度倍比稀釋至濃度為4. 72X103~4. 72X10 "copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線，根據(jù)擴增曲線 可看出該方法最低檢測靈敏度為5copies/μL。
[002引圖5巧光定量檢測DHAV-1她X通道）特異性試驗結(jié)果，共有21條曲線，其中，曲 線1~3為DHAV-1特異性擴增曲線，其它曲線4~21為表7所述鴨攝病毒、鴨疫里默式桿 菌等病原體核酸及陰性對照（健康鴨胚尿囊液、健康鴨胚胚體、健康鴨肝臟勻漿RNA陰性對 照）和空白對照。
[0024]圖6巧光定量RT-PCR檢測DHAV-3 (FAM通道）特異性試驗結(jié)果，共有21條曲線，其 中，曲線22~24為DHAV-3特異性擴增曲線，曲線25~42為表7所述鴨攝病毒、鴨疫里默 式桿菌等病原體核酸及陰性對照（健康鴨胚尿囊液、健康鴨胚胚體、健康鴨肝臟勻漿RNA) 和空白對照擴增曲線。
[00巧]圖7巧光定量RT-PCR檢測DHAV-1 (肥X通道）和DHAV-3 (FAM通道）特異性試驗 結(jié)果，共有42條曲線，其中，曲線1~3為DHAV-1特異性擴增曲線；曲線22~24為DHAV-3 特異性擴增曲線；曲線4~21、25~42分別為表7所述鴨攝病毒、鴨疫里默氏桿菌等病原 體核酸及陰性對照（健康鴨胚尿囊液、健康鴨胚胚體、健康鴨肝臟勻漿RNA)和空白對照擴 增曲線。
[002引圖8巧光定量RT-PCR檢測DHAV-1她X通道）批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果，曲線1~8分別