單克隆抗體的純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種從細胞培養(yǎng)物中純化單克隆抗體的改善方法。期望的單克隆抗體純化工藝包括親合層析、疏水相互作用層析和可選的離子交換柱層析。其提供大于99%純度的期望的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]從細胞培養(yǎng)基中純化藥物級單克隆抗體蛋白質(zhì)包括收獲/凈化(clarificat1n)，接著通過使用一系列的柱層析步驟與膜超濾和滲濾結(jié)合而純化。在純化之后，期望的抗體制劑經(jīng)適當配制并且存儲在合適的條件中。然而，很多時候，這些步驟無法提供具有其藥物應用所需的期望水平的純度和質(zhì)量的抗體。有時，在柱純化期間，觀察到工藝相關(guān)的和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)與期望的抗體一起共洗脫。因此，從期望的制劑中減少或去除這樣的雜質(zhì)是重要的。此外，蛋白質(zhì)聚集(團聚，aggregat1n)是在單克隆抗體(mAb)生產(chǎn)期間主要關(guān)心的問題。聚集體的存在可以降低單克隆抗體的療效并且已知在人類中引發(fā)免疫原應答(immunogenic responses) 0因此，在下游純化期間，主要通過柱層析從單克隆抗體期望的制劑中去除聚集體是必須的。為了解決此問題，本發(fā)明提供了純化抗體的新方法，其有助于以特定的方式通過使用一系列的柱層析從含有感興趣的抗體的無細胞培養(yǎng)基中去除連同高分子量聚集體的工藝-和產(chǎn)物-相關(guān)的雜質(zhì)達到期望的水平。在本發(fā)明中，所述純化抗體的工藝以直截了當?shù)姆绞阶C實良好控制的純化工藝產(chǎn)生具有大于80 %的回收率的高純度抗體制劑。在本發(fā)明中，高純度抗體制劑是指至少有99%的純度和基本上無工藝和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)和基本上沒有高分子量蛋白質(zhì)聚集體的抗體制劑。此外，本發(fā)明提供了一種高度可放大的(scalable)和可重復的純化單克隆抗體工藝。就工藝經(jīng)濟性和工業(yè)生存性而言，所描述的新純化工藝提供了一個用于純化不同的治療用途的抗體的公用平臺。
[0003]這樣的技術(shù)中的一些在以下專利中公開:
[0004]US 6417335公開了從包含抗體和污染物的組合物中純化抗體的方法，所述方法包括:(a)加載該組合物至陽離子交換樹脂上，其中在陽離子交換樹脂上加載的抗體的量是每mL陽離子交換樹脂約20mg至約35mg的抗體；以及(b)從該陽離子交換樹脂洗脫抗體。
[0005]US 7863426描述了從包含抗體和至少一種HCP的混合物中生產(chǎn)宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)減少的抗體制劑的方法，包括離子交換分離步驟，其中混合物易受到第一離子交換材料的影響，使得獲得HCP減少的抗體制劑。
[0006]本發(fā)明領(lǐng)域的其它相關(guān)專利是US 6489447 EP 1075488 ；EP1308455 ；EP1308456B等等。通過引用將上述中的每一個的全部內(nèi)容結(jié)合于此。
[0007]本發(fā)明提供了一種通過以獨特的方式采用常規(guī)柱層析技術(shù)從而獲得高純度的期望抗體制劑同時去除工藝-和產(chǎn)物-相關(guān)的雜質(zhì)(特別是蛋白質(zhì)聚集體)的新抗體純化工藝。我們在此公開了這樣的純化工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種源自細胞培養(yǎng)物的粗制混合物中純化單克隆抗體的方法。
[0009]在一個方面中，本發(fā)明提供了一種從粗制混合物中純化單克隆抗體的方法，其包括一系列柱層析和超濾-滲濾步驟。
[0010]在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種從粗制混合物中純化單克隆抗體的方法，其包括使用蛋白A親和層析與疏水相互作用層析步驟。蛋白G或蛋白L在親合層析步驟中可用作為柱基質(zhì)(matrix)。
[0011]在其它方面中，蛋白A親和層析步驟包括在用于結(jié)合的合適pH和/或電導系數(shù)(conductance)下，將含有期望抗體的粗制混合物加載至柱，接著在期望抗體以單峰形式洗脫之前進行柱沖洗。
[0012]在另一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括三個柱沖洗步驟，其中(i)利用平衡緩沖液的第一沖洗，(ii)在與第一沖洗緩沖液相同的pH和/或比第一沖洗緩沖液更高的電導率(conductivity)下的第二沖洗，(iii)在低于第二沖洗的pH和/或電導率下的第三沖洗，(iv)在比第三沖洗更低的pH和/或更高的電導率下洗脫抗體。
[0013]在另一個方面中，利用梯度降低(down-the-gradient)的鹽濃度進行根據(jù)本發(fā)明的疏水相互作用層析。
[0014]在進一步的方面中，本發(fā)明提供了一種從粗制混合物中純化單克隆抗體的方法，其包括蛋白A層析、疏水相互作用層析和離子交換柱層析。
[0015]在又一個方面中，本發(fā)明提供了一種從粗制混合物中純化單克隆抗體的方法，其包括與用于再調(diào)節(jié)(recondit1ning)蛋白溶液的超濾-滲濾相結(jié)合的蛋白A層析、疏水相互作用層析和離子交換柱層析。此處術(shù)語蛋白溶液是指污染蛋白質(zhì)和期望抗體的混合物或者通過本文所述的方法獲得的相對純的期望抗體制劑。
[0016]在其它方面中，根據(jù)本發(fā)明的離子交換層析選自陽離子交換層析和陰離子交換層析，優(yōu)選陰離子交換層析。
[0017]在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟:
[0018]1.蛋白A層析
[0019]2.疏水相互作用層析
[0020]3.陰離子交換層析
[0021]可以以任何次序進行疏水相互作用層析和離子交換層析步驟。
[0022]蛋白A柱步驟可用于從粗制混合物中捕獲單克隆抗體并可用于以結(jié)合-洗脫模式從柱中洗脫具有高純度水平的期望的單克隆抗體。疏水相互作用層析步驟用于以結(jié)合-洗脫模式進一步去除工藝-和產(chǎn)物-相關(guān)的雜質(zhì)。采用陰離子交換層析用于以流動-通過模式進一步去除工藝-相關(guān)的雜質(zhì)。
[0023]在一個方面中，可以根據(jù)本發(fā)明純化的抗體包括抗HER2抗體、抗TNF α抗體、抗VEGF抗體、抗⑶20抗體、抗⑶52、抗RANKL、抗IgE抗體等。
[0024]在其它方面中，本發(fā)明提供了一種在蛋白A親和層析步驟之后具有不大于5%的聚集體的量的抗體制劑。
[0025]在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種具有不大于1%，更優(yōu)選不大于0.5%的聚集體的量的抗體制劑。
[0026]在本說明書中使用的縮寫定義如下:
[0027]蛋白A:蛋白A交聯(lián)的瓊脂糖凝Jj父柱。
[0028]HIC:疏水相互作用柱層析。
[0029]AEX:陰離子交換柱層析。
[0030]ΗΡ-SEC:高效-體積排阻層析(high-perfomance-size exclus1nchromatography)ο
[0031]MWCO:分子量截留。
[0032]NaCl:氯化鈉。
[0033]WF1:注射用水。
【附圖說明】
[0034]圖1示出了通過蛋白A親合柱層析的阿達木單抗(adalimumab)的洗脫曲線。
[0035]圖2示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的蛋白A親合純化的阿達木單抗的純度。該圖示出了在第一次柱純化之后實現(xiàn)了阿達木單抗的純度大于99%。
[0036]圖3示出了通過疏水相互作用柱層析的阿達木單抗的洗脫曲線。
[0037]圖4示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的HIC純化的阿達木單抗的純度。該圖示出了在第二次柱純化之后實現(xiàn)了阿達木單抗的純度大于99 %。
[0038]圖5示出了阿達木單抗的陰離子交換柱層析曲線。
[0039]圖6示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的AEX柱純化的阿達木單抗的純度。該圖示出了在AEX柱純化之后實現(xiàn)了阿達木單抗的純度大于99%。
[0040]圖7示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的純化的阿達木單抗的純度。該圖示出了在最終制劑中在純化結(jié)束時實現(xiàn)了阿達木單抗的純度大于99 %。
[0041]圖8示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的HIC純化的利妥昔單抗(rituximab)的純度。該圖示出了在第二次柱純化之后實現(xiàn)了利妥昔單抗的純度大于99%。
[0042]圖9示出了通過分析HP-體積排阻層析(ΗΡ-SEC)的HIC純化的曲妥單抗(trastuzumab)的純度。該圖示出了在第二次柱純化之后實現(xiàn)了曲妥單抗的純度大于99%。
【具體實施方式】
[0043]本發(fā)明描述了通過使用一系列柱層析步驟純化源自細胞培養(yǎng)物的單克隆抗體的方法，包括與超濾和滲濾相結(jié)合的親和柱層析、疏水相互作用柱層析和離子交換柱層析。
[0044]在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種通過使用蛋白A柱層析首先捕獲，隨后可選地在添加劑/鹽存在下在低pH從柱中洗脫具有高純度水平的蛋白質(zhì)而從粗制混合物純化源自細胞培養(yǎng)物的單克隆抗體的方法。粗制混合物可以包括宿主細胞衍生的污染蛋白質(zhì)、產(chǎn)物有關(guān)的物質(zhì)和除感興趣的蛋白之外的其它雜質(zhì)。在親合層析步驟中，蛋白G或蛋白L可用作柱基質(zhì)。
[0045]在另一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括三個柱沖洗步驟，其中(i)利用平衡緩沖液的第一沖洗，(ii)在與第一沖洗緩沖液相同的pH和/或比第一沖洗緩沖液更高的電導率下的第二沖洗，(iii)在低于第二沖洗的pH和/或電導率下的第三沖洗，(iv)在比