一種利用雙酶協(xié)同水解制備章魚鈣螯合蛋白肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種金屬Ca螯合肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋 白酶二步分別酶解章魚蛋白制備的Ca螯合肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在章魚的養(yǎng)殖和加工過程中，大量的章魚下腳料被作為垃圾廢棄堆積，腐爛發(fā)臭， 甚至變質(zhì)，而造成經(jīng)濟(jì)的損失，并引起嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題。章魚作為一種高檔海產(chǎn)，在 進(jìn)行加工過程中，其廢棄下腳料的比例可占達(dá)45%以上，包括內(nèi)臟、軟骨、眼球、脖子等，而 這些下腳料中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及一些活性成分如牛磺酸、肉堿等，卻都未得到充 分利用。目前，國內(nèi)外多是關(guān)于章魚的生命體征及信息物質(zhì)等方面的研究，而關(guān)于章魚下腳 料的開發(fā)利用，及其副產(chǎn)品的研發(fā)探究的報(bào)道甚少。隨著活性肽研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起，我 們發(fā)現(xiàn)章魚蛋白源生物活性肽具有極高的營養(yǎng)價(jià)值、食用安全性及生理保健功能，可作為 功能性食品或食品添加劑乃至藥品應(yīng)用到人們?nèi)粘Ｉ钪小?br>[0003] 目前，鈣元素缺乏是全球性的營養(yǎng)問題，我國人民由于以植物性膳食為主，缺鈣的 現(xiàn)象更加嚴(yán)重，因此補(bǔ)鈣成為我國膳食營養(yǎng)研究中的重要課題。傳統(tǒng)的無機(jī)鈣鹽，如碳酸 鈣、磷酸鈣、氯化鈣等，對維生素有一定破壞作用，生物學(xué)效價(jià)較低；有機(jī)鈣鹽，如檸檬酸鈣、 乳酸鈣、葡萄糖鈣等，雖然鈣吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且價(jià)格高。研究表明， 蛋白肽螯合鈣由于其獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、安全無毒、價(jià)格低、可同時(shí)補(bǔ) 充多肽和鈣，而成為補(bǔ)鈣首選。
[0004] 因此，如何獲得具有金屬螯合鈣活性的肽，就成為制備新型鈣補(bǔ)充劑迫切的研究 方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶二步酶解章 魚蛋白制備的金屬螯合肽，使金屬Ca螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種金屬Ca螯合肽，是由4個(gè)氨基酸所構(gòu)成的四肽。所述多肽的氨基酸序列為：vevd。
[0007] -種金屬Ca螯合肽的制備方法，以章魚蛋白為原料，采用堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白 酶復(fù)配對其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
[0008] 所述酶解條件為：酶解章魚下腳料的最適酶解條件為料液比1:6,酶解時(shí)間5. 5h， 溫度51°C;在堿性蛋白酶酶解的基礎(chǔ)上，再添加風(fēng)味蛋白酶進(jìn)一步酶解。
[0009] 所述酶為堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，雙酶分步水解的最優(yōu)條件是：在堿性蛋白酶 酶解5. 5h后，加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解3. 5h。
[0010] 所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用T0Y0PEARLDEAE-650M陰離子交 換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有〇_〇. 5MNaCl的0.02mol/LpH9.0的磷酸緩 沖液，流速為0. 5mL/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測量；收集具有最高Ca螯合活性的峰， 再用SephadexG-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 3mL/min，洗脫 峰在214nm下進(jìn)行測定；收集具有最高Ca螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相 高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，分離條件是用0-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗 脫，至90%乙腈和10%水（v/v)的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為45min，流速為2 mL/min，收集具有最高金屬Ca螯合活性的峰即保留時(shí)間為31. 212min的洗脫峰，具有最 高金屬Ca螯合活性，得到所述的金屬螯合肽。
[0011] 本發(fā)明采取的具體步驟如下： (1)章魚蛋白酶解條件的優(yōu)化 本技術(shù)所采用的章魚蛋白來自東山博廣天興食品股份有限公司（中國?福建)，酶購自 諾維信生物技術(shù)有限公司（中國?天津)。采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別對四個(gè)酶解因素進(jìn)行考察， 分別為底物濃度（1%，3%，5%和7%)、酶解溫度（40，50，55和60°C)、料液比（1:2、1:3、1:4、 1:5、1:6、1:7，《八）以及酶解時(shí)間（1，3，5，7，9小時(shí))。稱取一定質(zhì)量章魚蛋白溶解于 蒸餾水中，然后用2mol/LNaOH將其pH調(diào)節(jié)至8. 0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著 再按不同的酶-底物配比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時(shí)間開始反應(yīng)。接著再在沸水 浴中滅酶10分鐘，冷卻后再lOOOOrpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對金屬Ca螯合活 性進(jìn)行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大金屬螯合活性的酶解液的酶解條件是：底 物濃度5%，酶解pH為8. 0、最適酶解條件為料液比1:6，酶解時(shí)間5. 5h，溫度51 °C。在堿性 蛋白酶酶解5. 5h后，加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解3. 5h，底物濃度5%，酶解pH為8. 0、最適酶 解條件為料液比1:6，溫度51°C。
[0012] (2)酶解產(chǎn)物的分離、純化 先在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過T0Y0PEARL DEAE-650M陰離子 交換色譜(長l〇〇cm，外徑2. 0cm)進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為0-0. 5 Μ的NaCl的0. 02 mol/L pH 9. 0的磷酸緩沖液，流速為0. 5 mL/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測量；收集具有最 高Ca螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝膠過濾色譜(長50 cm，外徑1.6 cm)進(jìn)行分離， 洗脫液為去離子水，流速為〇. 3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測定；收集具有最高Ca螯 合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，分離條件是 用0-90%(v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，至90%乙腈和10%水（v/v)的混合液結(jié)束， 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為45 min，流速為2 mL/min，收集具有最高金屬Ca螯合活性的峰 即保留時(shí)間為31. 212 min的洗脫峰，具有最高金屬Ca螯合活性，得到所述的金屬螯合肽。
[0013] ⑶金屬螯合活性的測試 鈣螯合活性的測試是金屬螯合肽對鈣離子的螯合作用。本發(fā)明將1mL5mmol/L的CaCljP2mL0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH8.0)加入具塞試管中，再加入1mL清蛋白 肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37°C溫育2h，取出后10000r/min常溫離心10min。取 1mL上清液，加入鄰-甲酸酞顯色液5mL，搖勾。放置10min后于分光光度計(jì)570nm處 測定吸光值，將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出可溶性鈣結(jié)合量。
[0014] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取標(biāo)準(zhǔn)Ca工作液（10ug/mL)0,0.2,0.4,0.6,0.8，1.0 mL于10mL試管中，分別加去離子水1. 0,0. 8,0. 6,0. 4,0. 2,0mL，加入鄰-甲酸酞顯色液5 mL，搖勾，放置10min后于分光光度計(jì)570nm處測定吸光值。以可溶性|丐含量（ug/mL)為 橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y = 0