一種維氏硝化桿菌及硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑及生產(chǎn)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及環(huán)境工程領(lǐng)域，具體涉及一種維氏硝化桿菌及硝化細(xì)菌-反 硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑及生產(chǎn)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水作為人類賴以生存的資源，在不斷污染的同時(shí)又亟待進(jìn)行治理。隨著生物修復(fù) 方法愈來(lái)愈被人類所重視，硝化細(xì)菌及反硝化細(xì)菌的應(yīng)用也逐漸提升到一個(gè)新的高度。
[0003] 微生物脫氮主要通過(guò)硝化-反硝化的過(guò)程實(shí)現(xiàn)，其中硝化過(guò)程的主要承擔(dān)者為硝 化細(xì)菌，而反硝化過(guò)程的主要承擔(dān)者為反硝化細(xì)菌。硝化細(xì)菌分為氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽 氧化細(xì)菌兩大類，在有氧氣存在的條件下它們可以將氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮；在無(wú)氧或低氧 的條件下，通過(guò)反硝化細(xì)菌的反硝化作用，將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的N20或N2從水體移出， 最終實(shí)現(xiàn)水體中氮素的脫除。
[0004] 由于硝化細(xì)菌為無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)型細(xì)菌，其生長(zhǎng)緩慢，工業(yè)化生產(chǎn)困難，而且單一的 硝化細(xì)菌并不能實(shí)現(xiàn)水體氮素的完全脫除，應(yīng)用過(guò)程中往往造成大量的總氮積累，為了有 效消除總氮，人們往往通過(guò)后期投加反硝化細(xì)菌的方式實(shí)現(xiàn)脫氮。而目前正規(guī)的自養(yǎng)硝化 細(xì)菌均為液體菌劑，反硝化細(xì)菌為固體菌劑，兩種菌劑產(chǎn)品采用不同的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)，無(wú)法 實(shí)現(xiàn)混合發(fā)酵或者簡(jiǎn)單復(fù)合，這兩類菌劑的分開(kāi)生產(chǎn)和應(yīng)用在一定程度上增加了菌劑的生 產(chǎn)成本和應(yīng)用的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種維氏硝化桿菌，該菌株已于2014年5月14日，送 往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：維氏硝化桿菌（NitrobacterWinogradskyi) Y3-2,CCTCCNO:M2014203,地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0006] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了維氏硝化桿菌（NitrobacterWinogradskyi) Y3-2的應(yīng)用，該菌劑可以快速消除水體中的亞硝酸鹽，能有效消除水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸 鹽積累，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長(zhǎng)，也可用于污水處理廠中，促進(jìn)硝化作用，提高污水處理廠 脫氮效率。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑，該菌劑包 括歐洲亞硝化單胞菌（ATCC19718)，維氏硝化桿菌Y3-2(CCTCCNO:M2014203)和施氏假單 胞菌（ATCC17588)。
[0008] 本發(fā)明的還有一個(gè)目的在于針對(duì)硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中遇到的問(wèn)題 及實(shí)際應(yīng)用中的困難，提出了一種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌菌劑混合培養(yǎng)的方法，方法簡(jiǎn)單， 易行。
[0009] 本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了一種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑的應(yīng)用，該 菌劑可有效脫除水體中的氮素，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0011] 一種維氏硝化桿菌，通過(guò)以下方式得到：
[0012] 維氏硝化桿菌菌株是發(fā)明人于2008年在武漢市龍王廟污水處理廠活性污泥中 富集、分離、純化得到。該菌株已于2014年5月14日，送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏，分類命名：維氏硝化桿菌（NitrobacterWinogradskyi)Y3_2,保藏編號(hào)：CCTCCN0: M2014203,地址：武漢武漢大學(xué)。
[0013] 維氏硝化桿菌Y3-2細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，細(xì)菌形態(tài)見(jiàn)圖1所示。革蘭氏陰性。嚴(yán)格化能 自養(yǎng)型，只能通過(guò)氧化亞硝酸鹽獲得能量。生長(zhǎng)需要嚴(yán)格好氧，pH6. 5-8. 5,生長(zhǎng)溫度范圍 為10-40°C，最適生長(zhǎng)溫度為30°C，屬于淡水硝化細(xì)菌，可耐受鹽的濃度范圍為0_15000mg/ L。該菌具備高效消除Ν02-Ν的能力，單獨(dú)發(fā)酵的培養(yǎng)菌液，硝化速率可以到達(dá)800-3000mg N02-N/L/h，通常為1000mgN02-N/L/h，按照萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之一的量（體積比）接種污染 水體，可使水體亞硝酸氧化速率達(dá)到l-5mgN02-N/L/h。
[0014] -種維氏硝化桿菌的應(yīng)用，包括其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，以及污水處理中的應(yīng)用。 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于消除水體亞硝酸鹽積累，改良水質(zhì)，從而促進(jìn)了養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)；在污水處 理廠中用于促進(jìn)水體硝化作用，加速了污水硝化-反硝化脫氮過(guò)程。
[0015] -種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌菌劑，該菌劑包括歐洲亞硝化單胞菌，維氏硝化桿菌 和施氏假單胞菌。
[0016] 優(yōu)選的，所述菌劑的各組分的配比為：歐洲亞硝化單胞菌：維氏硝化桿菌：施氏假 單胞菌為 1X1〇7-5X10scfu/ml: 1X107-5X10scfu/ml: 1X10s-lX109cfu/ml。
[0017] 優(yōu)選的，所述的歐洲亞硝化單胞菌為ATCC19718,為一種自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌。
[0018] 維氏硝化桿菌為維氏硝化桿菌Y3-2,CCTCCNO:M2014203。
[0019] 施氏假單胞菌為ATCC17588,為一種反硝化細(xì)菌。
[0020] 一種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：
[0021] A、配制硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)基；
[0022] B、按照培養(yǎng)基體積的2% -20 %的量接種歐洲亞硝化單胞菌，每隔6_12h補(bǔ)料 (NH4)2S04或NH4C1，使培養(yǎng)基中NH4-N終濃度維持在75-255mg/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)3-4天；培養(yǎng) 溫度25-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm;
[0023] C、在步驟B的基礎(chǔ)上，按照初始硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)基體積的2 % -20 %的量接種維 氏硝化桿菌，并繼續(xù)按照步驟B的方法繼續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)溫度25-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為 15〇-250rpm；
[0024] D、補(bǔ)料培養(yǎng)硝化細(xì)菌結(jié)束后，在硝化細(xì)菌培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上加入反硝化有機(jī)營(yíng)養(yǎng) 液，并接種施氏假單胞菌；接種量為初始硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)基體積的1% _5%，培養(yǎng)溫度 25-35°C，接種后24h內(nèi)攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm，24h后靜置培養(yǎng)，當(dāng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中硝酸 鹽和亞硝酸鹽濃度均為〇mg/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。
[0025] 所述的硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)基的配方包括：NaCl0· 3g/L，MgS04 · 7H20 0· 04g/ L，F(xiàn)eS04 0· 0396g/L，（NH4)2S04 0· 5g/L，K2HP04 · 3H20 4. 108g/L，KH2P04 0· 272g/L，pH 7. 5-8. 5,其余為水。
[0026] 所述的反硝化有機(jī)營(yíng)養(yǎng)液的配方包括：乙酸鈉20_40g/L;酵母膏、酵母浸粉、酵母 提取物或酵母浸膏其中一種或組合5_20g/L，其余為水。
[0027] 所述的在硝化細(xì)菌培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上加入反硝化有機(jī)營(yíng)養(yǎng)液，其特征在于，添加的 反硝化有機(jī)營(yíng)養(yǎng)液是初始硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)基體積的5% -20%。
[0028] 優(yōu)選的，所述的歐洲亞硝化單胞菌為ATCC19718
[0029] 維氏硝化桿菌為維氏硝化桿菌Y3-2,CCTCCNO:M2014203。
[0030] 施氏假單胞菌為ATCC17588。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0032] ①維氏硝化桿菌Y3-2具有高效消除Ν02-Ν的能力，硝化速率可以達(dá)到 800-3000mgN02-N/L/h，通常為1000mgN02-N/L/h，而現(xiàn)有硝化細(xì)菌亞硝酸氧化能力通常低于 500mgN02-N/L/h〇
[0033] ②在制備硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑中，本發(fā)明縮短了發(fā)酵時(shí)間，具有更高 的發(fā)酵生產(chǎn)效率。本發(fā)明方法采用氨氧化細(xì)菌ATCC19718、亞硝酸鹽氧化菌Y3-2、反硝化細(xì) 菌ATCC17588分階段連續(xù)混合培養(yǎng)的方式，可以有效縮短其培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間由之前3種 菌單獨(dú)培養(yǎng)總共需要14天縮短至6天，縮短57%，提高了生產(chǎn)效率。
[0034] ③本發(fā)明充分利用了培養(yǎng)基組分，可以有效降低生產(chǎn)成本。硝化細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中 將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，硝酸鹽又被反硝化細(xì)菌利用，一部分作為氮 源，一部分轉(zhuǎn)為為氮?dú)饷摮?。其他微量元素都可以被上?種微生物共同利用。
[0035] ④本發(fā)明得到的聚合體產(chǎn)品培養(yǎng)液中最終基本不含無(wú)機(jī)氮，不會(huì)因?yàn)樵谖鬯写?量使用該菌劑而將無(wú)機(jī)氮帶入水體中，增加水體N素污染程度。
[0036] ⑤本發(fā)明方法最終得到一種硝化細(xì)菌-反硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑，該復(fù)合菌劑能實(shí)現(xiàn) 完整的硝化-反硝化過(guò)程，相比于單一的硝化細(xì)菌或反硝化細(xì)菌能夠更有效的脫除水體中 的氮素，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為維氏硝化桿菌Y3-2掃描電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于實(shí)施 例的范圍。
[0039] 本發(fā)明所述的維氏硝化桿菌Y3-2為發(fā)明人分離自湖泊沉積物，分屬于維氏硝化 桿菌，拉丁文名NitrobacterWinogradskyi(CCTCCM:2014203)。
[0040] 實(shí)施例中的歐洲亞硝化單胞菌ATCC19718和施氏假單胞菌ATCC17588,購(gòu)自上海 復(fù)祥生物科技有限公司。
[0041] 實(shí)施例中硝化細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的確定，以nh4-n和no2-n的定性檢測(cè)方法為準(zhǔn)，從培 養(yǎng)開(kāi)始，每天定性檢測(cè)nh4-n和no2-n，至定性檢測(cè)顯示nh4-n和no2-n均完全消耗完為培養(yǎng) 結(jié)束，期間為半連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間。
[0042] 實(shí)施例中反硝化細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的確定，以Ν02-Ν和Ν03-Ν的定性檢測(cè)方法為準(zhǔn)，從 接種施氏假單胞菌開(kāi)始，每天定性檢測(cè)no2-n和no3-n，至定性檢測(cè)顯示no2-n和no3-n均完 全消耗完，期間為批次培養(yǎng)時(shí)間。
[0043] 實(shí)施例中兩種硝化細(xì)菌的菌濃度均以Real-timePCR的方法進(jìn)行測(cè)定，反硝化細(xì) 菌濃度以稀釋涂平板的方法進(jìn)行測(cè)定。
[0044] 歐洲亞硝化單胞菌ATCC19718單菌發(fā)酵，采用本發(fā)明的硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，消耗等 量NH4-N的情況下，需要6天時(shí)間；維氏硝化桿菌Y3-2單菌發(fā)酵，消耗等量Ν02-Ν的情況下， 需要6天時(shí)間；而反硝化細(xì)菌ATCC17588單獨(dú)發(fā)酵，需要本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)液，并額外添加ΚΝ03， 需要發(fā)酵2天才可以達(dá)到本發(fā)明所得混合菌劑中ATCC17588的濃度，3種菌劑單獨(dú)發(fā)酵總時(shí) 長(zhǎng)為14天。
[0045] 實(shí)施例1 :
[0046] 一種維氏硝化桿菌Y3-2,通過(guò)以下方式得到：
[0047] 該菌株是發(fā)明人于2008年在武漢市龍王廟污水處理廠活性污泥中富集、分離、純 化得到。該菌株已于2014年5月14日，送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：維 氏硝化桿菌（NitrobacterWinogradskyi)Y3_2,保藏編號(hào)：CCTCCN0:M2014203,地址：武 漢武漢大學(xué)。
[0048] 該菌劑單獨(dú)培養(yǎng)的方法，采用硝化細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，pH8. 0-8. 5,溫度30°C， 接種量 10%