一株鞘氨醇單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別是一株可增強(qiáng)韭菜中殘留毒死蜱降解的鞘氨醇單胞 菌（敵was職）及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 毒死蜱（chlorpyrifos)是美國陶氏益農(nóng)化學(xué)公司于1965年研發(fā)出來的一種高 效、低毒、廣譜、低殘留及低抗藥性的有機(jī)磷殺蟲殺螨劑。有效成分的化學(xué)名稱為〇, 〇-二乙 基-0-(3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯（0,0-(1丨61:1171-0-(3,5,6-1：1'；[(311101'0-2-pyridyl，phosphorothioate)。毒死蜱在室溫及酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中則易分解， 難容于水，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。由于高毒有機(jī)磷農(nóng)藥被禁用，毒死蜱作為有效的取代 產(chǎn)品，在用量和使用范圍上越來越大，在我國廣泛應(yīng)用于水稻防治稻飛虱、水稻螟蟲，韭菜 等防治根蛆以及葉菜類蔬菜防治蚜蟲、螨類等害蟲，如目前田間一般使用48%毒死蜱乳油 500-800倍稀釋液灌根，用以防治韭菜根蛆；但是與其他有機(jī)磷農(nóng)藥相同，毒死蜱也存在殘 留和對生態(tài)環(huán)境的潛在威脅性，在我國由于大量以及不合理的使用，使得毒死蜱在稻米及 蔬菜中的農(nóng)殘超標(biāo)，成為發(fā)達(dá)國家設(shè)置綠色貿(mào)易壁皇的重要手段，對我國對人民健康產(chǎn)及 農(nóng)產(chǎn)品出口造成重大的影響。
[0003] 目前毒死蜱在農(nóng)產(chǎn)品中的去除一般采用清洗和輻照技術(shù)，但是這些方法只能清洗 或去除農(nóng)產(chǎn)品表面的農(nóng)藥殘留，同時(shí)還有可能造成農(nóng)產(chǎn)品外觀及品質(zhì)方面的損害。因此，如 何在不損害農(nóng)產(chǎn)品外觀品質(zhì)的前提下，高效降解殘留的農(nóng)藥毒死稗，一直是本領(lǐng)域亟待解 決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明一株可增強(qiáng)韭菜中殘留毒死蜱降解的鞘氨醇單胞菌，在不 影響作物生長及農(nóng)產(chǎn)品安全的前提下，可提升韭菜對毒死蜱的降解能力，從源頭上降低毒 死蜱的在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的： 一株鞘氨醇單胞菌肅wassp.)，其保藏編號為CGMCCNo. 11031 ;所述鞘氨醇 單胞菌菌株為革蘭氏陰性，菌體直桿狀，帶有鞭毛，無內(nèi)生芽孢。
[0005] 本發(fā)明中所提供的鞘氨醇單胞菌在增強(qiáng)韭菜中殘留毒死蜱降解中的應(yīng)用。
[0006] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述氨醇單胞菌的應(yīng)用是指，利用HJY菌劑對韭菜進(jìn)行浸根處理， 用以增強(qiáng)韭菜中殘留毒死蜱的降解； 該HJY菌劑是這樣獲得的： A) 將保藏編號為CGMCCNo. 11031的鞘氨醇單胞菌接種至LB培養(yǎng)基，30°C劃線、挑 單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落于菌種活化培養(yǎng)基中，30°C，150-200rpm搖床振蕩培養(yǎng) 12-24h，獲得活化菌種； B) 向裝有種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐接種活化菌種，接種量為種子培養(yǎng)基體積的1%， 25-38°C，通空氣培養(yǎng)16-24h，得到液體種子； C) 向裝有種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐接種液體種子，接種量為種子培養(yǎng)基體積的1%， 30-35°C，150rpm下避光培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到活菌體培養(yǎng)物； D) 取活菌體培養(yǎng)物50ml于4 °C、5000rpm下離心15min，取沉淀菌體用0. 85%的無 菌生理鹽水沖洗3次，再用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至含菌量為lOlfu/mL，即獲得HJY菌劑； LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水至1L，121°C滅菌20 min； 菌種活化培養(yǎng)基：胰蛋白胨l〇g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加水至1L，121°C滅菌20 min; 種子培養(yǎng)基：K2HP04 4. 8g，KH2P04 3.5g，（NH4)2S04 2g，MgCl2 0.16g，CaCl2 0.02g， Na2Mo04.2H20 0.0024g，F(xiàn)eCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0,加水至lL，12rC滅菌 20min〇
[0007] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述氨醇單胞菌的應(yīng)用是指，在韭菜移栽前，將韭菜根浸沒于HJY 菌劑稀釋液中，浸泡24h后再進(jìn)行田間移栽；所述HJY菌劑稀釋液是由無菌生理鹽水將含菌 量為lOlfu/mL的HJY菌劑稀釋至含菌量為103-104cfu/mL后獲得。
[0008] 相對于現(xiàn)有降解作物中農(nóng)藥毒死稗殘留的技術(shù)，本發(fā)明獲得的鞘氨醇單胞菌可長 期定植于韭菜根部，可增強(qiáng)農(nóng)作物降解殘留毒死蜱的活性，在不影響農(nóng)作物品質(zhì)的前提下， 高效降解農(nóng)藥殘留，綠色無污染，適宜廣泛推廣使用。
【附圖說明】
[0009] 圖1為鞘氨醇單胞菌HJY顯微鏡圖； 圖2為鞘氨醇單胞菌HJY菌落形貌圖片； 其中，（A)為加富培養(yǎng)基培養(yǎng)，（B)為MSM培養(yǎng)基； 圖3為16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育示意圖； 圖4增強(qiáng)農(nóng)作物降解毒死稗結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng)基： LB培養(yǎng)基：10g胰蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化鈉，去離子水1000mL;121°C滅菌20 min〇
[0011]無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM) :0· 4gMgS047H20,0. 2gFeS047H20,0. 2gΚ2ΗΡ04,0· 2g (NH4)2S04,0 . 08gCaS04,去離子水 1000mL，pH7.0-7.2。，121°(：滅菌 20min; 加富培養(yǎng)基（固體，1L): 0.4gMgS047H20,0.2gFeS047H20,0.2gΚ2ΗΡ04,0·2g(NH4)2S04,0 . 08gCaS04，1000mg蛋白胨，1000mg牛肉膏，瓊脂 20g，去離子水 1000mL，pH 7. 0-7. 2,121°C滅菌20min，用于菌株的斜面保存和平板培養(yǎng)。
[0012] 菌種保藏培養(yǎng)基（固體，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水 至 1L，121°C滅菌 20min。
[0013] 菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加水至1L， 121°C滅菌 20min。
[0014] 種子培養(yǎng)基（液體，1L) :K2HP04 4. 8g，KH2P04 3. 5g，（NH4) 2S04 2g，MgCl2 0· 16g， CaCl2 0.02g，Na2Mo04.2H20 0.0024g，F(xiàn)eCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0;121°C* 菌20 min〇
[0015] 實(shí)施例1篩選菌株 1、菌株的獲得 (1) 樣品采集：2012年10月，在江蘇省南京市江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)田中采集經(jīng)毒死 蜱選擇壓力馴化的韭菜新鮮植株樣本，用自來水將植株表面附帶灰塵泥土沖洗干凈，自然 風(fēng)干，按下述程序進(jìn)行表面消毒：75%酒精浸泡3-5min，然后用無菌水沖洗3-4次，用2. 5% NaC102漂洗2-5min，最后用無菌水清洗5次； (2) 菌株分離篩選：分別取韭菜根莖葉進(jìn)行組織研磨，吸取汁液均勻涂布于加富培養(yǎng) 基平板上，于30°C條件下避光培養(yǎng)2-7天。
[0016] (3)菌株富集培養(yǎng)：待長出菌落后，挑取單菌落進(jìn)一步劃線于含毒死蜱的無機(jī)鹽 培養(yǎng)基（MSM)(毒死蜱含量50mg/L，該培養(yǎng)基以毒死蜱為單一碳源)，于30°C條件下避光培 養(yǎng)2-7天，選取能連續(xù)5次在只含毒死蜱（50mg/L)作為唯一碳源的MSM上生長的菌株； (4)菌株純化：采用平板劃線分離法純化，挑取在最高濃度下(毒死蜱100mg/L)生長的 菌落在富集培養(yǎng)基上劃線，直到分離獲得純培養(yǎng)物。
[0017] 經(jīng)上述方法篩選獲得1株高效毒死蜱降解菌，申請人將其自命名為菌株HJY，其生 理生化特征見表1 :
*+代表反應(yīng)呈陽性，-代表反應(yīng)呈陰性。
[0018] 菌株HJY顯微照片如圖1所示，經(jīng)檢測，該菌株為革蘭氏陰性，直桿狀，帶有鞭毛 而無內(nèi)生芽孢，其在加富培養(yǎng)基(含毒死蜱100mg/L)和LB培養(yǎng)基上生長較快，在加富培養(yǎng) 基(含毒死蜱100mg/L)中菌落生長48h如圖2 (A)所示，菌落呈亮黃色，質(zhì)地光滑，濕潤粘 稠；而在以毒死蜱為唯一碳源的MSM平板上(含毒死蜱50mg/L)生長相對緩慢，如圖2 (B) 所示，菌落開始時(shí)稀薄，呈白色，生長36 h后菌株變?yōu)榈S色，質(zhì)地光滑粘稠。
[0019] 菌株HJY的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了GenBank數(shù)據(jù)庫，登記號為： KM985687,其16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育如圖3所示，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用 blast程序與已登錄細(xì)菌菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明其與鞘氨醇單胞菌 5A)相似性最高，可以達(dá)到99%以上，因此確定其為鞘氨醇單胞菌。
[0020] 申請人于2015年7月2日將該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（CGMCC)，地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中，國科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101;其保藏編號為CGMCCNo.11031，分類命名為鞘氨醇單胞菌 sp.〇
[0021] 實(shí)施例2制備HJY菌劑 1、 菌種活化：挑取實(shí)施例1獲