一株高產(chǎn)地衣素的地衣芽孢桿菌工程菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于涉及一株產(chǎn)地衣素（lichenysin)的地衣芽胞桿菌工程菌及其構(gòu)建方 法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物表面活性素具有較高的表面活力，與化學(xué)類(lèi)表面活性劑相比，其無(wú)毒、可降解 等環(huán)境友好特性，使其在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、化妝品和微生物采油等方面有很大的應(yīng)用潛力。 由枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肽Surfactin(表面活性素），是迄今為止研究得最多的表面活 性素之一。由于surfactin較高的表面活性，它被公認(rèn)為是目前已知的效果最好的生物表 面活性劑之一。地衣素是由地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肽類(lèi)物質(zhì)，其典型肽鏈順序?yàn)長(zhǎng)-Glnl -D-Leu2 -L-Leu3 -L-Val4 -L-Asp5 -D-Leu6 -L-Ile7,肽鏈與含有 12-17 個(gè)碳的不飽和 脂肪酸鏈以β羥基連成環(huán)狀。它與surfactin在結(jié)構(gòu)及生物合成方面都具有極高的相似 性。地衣素與Surfactin相比具有更強(qiáng)的表面活性和溶血活性，其對(duì)鈣離子的螯合作用也 較強(qiáng)。但由于表面活性素家族發(fā)酵產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，限制了它的應(yīng)用推廣和研究發(fā)展。
[0003] 在提高地衣素產(chǎn)量的研究中，多數(shù)學(xué)者將注意力放在地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)化 方面。1996年Yakimov等人通過(guò)向B.licheniformisBAS50發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-glutamic acid和L-asparagine，使地衣素A產(chǎn)量分別提高了 2倍和4倍。2007年Joshi等人利用響 應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組分，使B.licheniformisK51的臨界膠束稀釋倍數(shù)提高了 10倍。而后 他們利用相同的方法使B.licheniformisR2在優(yōu)化培養(yǎng)基中的地衣素產(chǎn)量提高了 4倍，獲 得濃度達(dá)到1.lg/L的地衣素粗提物。此外，Lin等人利用N-甲基-Ν'-硝基-N-亞硝基 胍對(duì)B.licheniformisJF-2進(jìn)行隨機(jī)誘變，發(fā)現(xiàn)突變株B.licheniformisKGL11的地衣素 產(chǎn)量達(dá)到391mg/L，比原始菌株提高了 12倍。然而即使優(yōu)化培養(yǎng)基，使用廉價(jià)的生產(chǎn)原料以 及優(yōu)化發(fā)酵后處理工藝，整個(gè)發(fā)酵工藝是否經(jīng)濟(jì)效益化仍然取決于使用的生產(chǎn)菌株是否高 產(chǎn)，因此，選育高產(chǎn)、穩(wěn)定的出發(fā)菌株是亟需解決的問(wèn)題，而這正是本發(fā)明的研究重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高產(chǎn)地衣素的地衣芽胞桿菌工程菌，所述 重組菌是由克隆枯草芽胞桿菌168中surfactin合成酶的啟動(dòng)子Psrf，通過(guò)同源重組技術(shù) 替換菌株地衣芽胞桿菌WX-02的地衣素生物合成基因簇的啟動(dòng)子P1A構(gòu)建而成的重組地衣 芽胞桿菌。
[0005] 所述啟動(dòng)子Psrf基因片段來(lái)源于GenBankAL009126.3(序列如SEQ ID N0 :1)，于 同源重組的同源臂上臂Psrf-up基因片段來(lái)源于GenBankΗΙΗΠΟΟΟΟΟΙ.1(序列如SEQ ID NO :2)，同源臂下臂Psrf-down基因片段來(lái)源于GenBank AHIF01000001. 1(如SEQ ID NO : 3) 〇
[0006] 將啟動(dòng)子Psri；片段和同源臂Psrf-up、Psrf_downp利用S0E-PCR反應(yīng)連接在一起， 得到拼接片段Psrflch。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XbaI對(duì)Psrflch片段和T2(2)-〇ri 進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將Psrflch片段插入質(zhì)粒T2 (2) -ori的BamH I和Xba I位點(diǎn)之 間，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證確定為陽(yáng)性克隆后，測(cè)序驗(yàn)證，得到重 組質(zhì)粒T2 (2) -Psff。再將測(cè)序驗(yàn)證正確的載體T2 (2) -Psrf電轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌WX-02中 得到重組菌B. licheniformis WX02_Psrflch。
[0007] 所述重組菌生長(zhǎng)地衣素的工藝為：
[0008] (1)種子培養(yǎng)：
[0009] 種子培養(yǎng)基：6-10g/L蛋白胨；2-8g/L酵母浸出粉；15g/L氯化鈉；ρΗ7· 0-7. 2;固 體培養(yǎng)基加瓊脂15g/L;
[0010] 種子培養(yǎng)：250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)到 0D600 為 1. 0 ;
[0011] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：
[0012] Copper's基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2g/L;硝酸銨4g/L;磷酸氫二鈉40mmol/L;磷 酸二氫鉀 30mmol/L;硫酸鎂 0. 8mmol/L;硫酸亞鐵 300μmol/L;硫酸猛 200μmol/L; 氯化鈣7. 0μΜ;乙二胺四乙酸二鈉鹽4. 0μΜ;pH7. 0 ;地衣素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10-50g/L;硝酸銨 2-6g/L;磷酸氫二鈉 20-160mmol/L;磷酸二氫鉀 15-120mmol/L;硫酸鎂 0· 4-1. 2mmol/L;硫酸亞鐵 75-1200μmol/L;硫酸錳 100-800μmol/L;氯化鈣 7. 0μmol/L; 乙二胺四乙酸二鈉鹽4.0μmol/L;ρΗ7·0。
[0013]發(fā)酵培養(yǎng)條件：250mL三角瓶，裝液量30mL，發(fā)酵溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速240r/min，發(fā) 酵時(shí)間48h。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了地衣素合成由枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子Psrf 控制下在地衣芽孢桿菌中合成表達(dá)，且證明了啟動(dòng)子Psrf是可在地衣芽孢桿菌中應(yīng)用的高 效的外源啟動(dòng)子。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖 1 重組質(zhì)粒T2(2)_Psff中同源臂Psrf-up、Psrf_down、插入片段Psrf及S0E-PCR 融合片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道M:DL5000DNA分子量Maker;泳道1 :同源臂上臂Psrf-up PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（引物PF/Psrf-upR;片段長(zhǎng)度842bp);泳道2 :同源臂下臂Psrf-downPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（引物Psrf-downF/PR;片段長(zhǎng)度932bp);泳道3 :啟動(dòng)子PsrfPCR擴(kuò)增產(chǎn)物（引 物Psrf-F/Psff-R;片段長(zhǎng)度626bp);泳道4 :S0E-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（引物PF/PR;片段長(zhǎng)度 2306bp)。
[0016] 圖2重組菌的PCR驗(yàn)證。分別以重組菌B. licheniformis WX02_Psrflch總DNA 和親本菌株WX-02總DNA為模板，利用不同的引物擴(kuò)增進(jìn)行PCR驗(yàn)證，WX-02作為對(duì)照。泳 道M :DL5000DNA分子量Maker ;泳道1、2 :以Ver-L和Psrf-VR作為引物擴(kuò)增（以重組菌總 DNA為模板擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1599bp，WX-02中無(wú)特異性條帶）；泳道3、4 :以Psrf-VL和Ver-R 作為引物擴(kuò)增（以重組菌總DNA為模板擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1691bp，WX-02中無(wú)特異性條帶）；泳 道5、6 :以Ver-L和Ver-R作為引物擴(kuò)增（以重組菌總DNA為模板擴(kuò)增片段長(zhǎng)度3169bp，以 WX-02總DNA為模板擴(kuò)增片段長(zhǎng)度3305bp)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1.重組質(zhì)粒T2 (2) -Psrf的構(gòu)建
[0018] 用于擴(kuò)增枯草芽胞桿菌168中surfactin合成酶的啟動(dòng)子Psrf的引物：
[0019] Psrf-F: 5 ' -CCATGTAGCAGGCGAAACTCAGCCTGCGACGCTCTTCGCAAGGGTGTC-3 '
[0020] Psrf-R:5'-GTCAGCGGGTAAAATGTGTTTCCCATATTGTCATACCTCCCCTAATC-3 '
[0021] 以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板PCR得到Psrf基因片段。
[0022] 用于擴(kuò)增地衣芽胞桿菌WX-02中地衣素啟動(dòng)子P1A上游片段（同源臂上臂） Psff-up的引物：
[0023] PF: 5 ' -CGCGGATCCACGTATGCGCAGGGGAAAATGGATTG-3 '（下劃線序列表示限制性?xún)?nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)BamHI)
[0024] Psrf-upR: 5' -GACACCCTTGCGAAGAGCGTCGCAGGCTGAGTTTCGCCTGCTACATGG-3 '
[0025] 以地衣芽孢桿菌WX-02基因組DNA為模板PCR得到Psrf-up基因片段。
[0026] 用于擴(kuò)增地衣芽胞桿菌WX-02中地衣素啟動(dòng)子P1A下游片段（同源臂下臂） Psrf-down的引物：
[0027] Psrf-downF: 5' -GATTAGGGGAGGTATGACAATATGGGAAACACATTTTACCCGCTGAC-3 '
[0028] PR:5' -GCTCTAGATTCAATGGAGGCTTTCATCGGAATCGTC-3'（下劃線序列表示限制性?xún)?nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)XbaI)
[0029] 以地衣芽孢桿菌WX-02基因組DNA為模板PCR得到Psrf-down基因片段。
[0030] Psrflch片段是利用Psrf基因片段、Psrf-up片段和Psrf-down片段為模板，引物 PF和PR作為引物進(jìn)行S0E-PCR擴(kuò)增得到的。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XbaI對(duì)Psrflch 片段和T2 (2) -ori進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將Psrflch片段插入質(zhì)粒T2 (2) -ori的BamHI 和XbaI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒T2 (2) -Psrf。
[0031] 實(shí)施例2.地衣素合成酶啟動(dòng)子的置換
[0032] 將測(cè)序驗(yàn)證正確的載體T2 (2) -Psrf電轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌WX-02。接種地衣芽胞桿 菌WX-02于5mLLB培養(yǎng)基，37°C，180r/min過(guò)夜培養(yǎng)；過(guò)夜培養(yǎng)物2. 5mL轉(zhuǎn)接至50mL地衣 芽胞桿菌的電轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，250r/min，37°C2h(0D600為0. 8~0. 9)，將搖瓶置冰浴 10mia;5500r/min離心6min后收集菌體，用地衣芽胞桿菌的電轉(zhuǎn)化洗滌培養(yǎng)基洗滌菌體3 次（30mL洗滌液/次），最后重懸于lmL洗滌培養(yǎng)基中，并迅速分裝于1. 5mL離心管中，每管 100μL，-80°C保存，即為感受態(tài)細(xì)胞。取一管感受態(tài)細(xì)胞加入5μL質(zhì)粒DNA(50ng/μL)，將 細(xì)胞轉(zhuǎn)至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯（〇. 2cm)中，冰浴1~1. 5min，用電脈沖轉(zhuǎn)化儀2. 5kV電擊1次， 電擊完后迅速加900μL地衣芽胞桿菌的電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基，37 °C下恒溫水浴lh，再在搖床 上100r/min恢復(fù)培養(yǎng)2h，涂含有20μg/mL的卡那霉素抗性平板，37°C培養(yǎng)20h，篩選轉(zhuǎn)化 子。
[0033] 挑取陽(yáng)性克隆單菌落在含抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，然后在含抗生素的LB平 板上劃線，45°C培養(yǎng)