一種誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于發(fā)育生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷和修復(fù)是神經(jīng)性視覺(jué)損傷發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸共同的科學(xué)問(wèn)題。近年隨著干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stemcells, iPSCs)為視覺(jué)神經(jīng)損傷的修復(fù)與治療帶來(lái)了新的希望。由于iPSCs自我復(fù)制和多分化潛能，作為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的供體不但能滿足移植時(shí)所需的細(xì)胞量，而且iPSCs在一定條件下能誘導(dǎo)分化為包括神經(jīng)元在內(nèi)的不同的神經(jīng)細(xì)胞系。因此，將人源性的iPSCs通過(guò)移植治療視覺(jué)神經(jīng)損傷并恢復(fù)機(jī)體功能，具有重要的理論意義和良好的臨床治療前景。研究發(fā)現(xiàn)將iPS細(xì)胞直接移植到受損的視網(wǎng)膜組織后，90%以上的細(xì)胞均分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，幾乎沒(méi)有神經(jīng)元的存在。而神經(jīng)元對(duì)損傷后視功能的恢復(fù)起著決定性的作用。因此，能否在體外將iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為特定的視網(wǎng)膜神經(jīng)元就成為制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。
[0003]眾多的研究表明，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)可特異性地促進(jìn)iPS分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NF)、視黃酸等均可促進(jìn)iPS向神經(jīng)元方向分化。NT4、BDNF可保護(hù)中樞神經(jīng)元免受興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的損害，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜內(nèi)鈣離子的水平而保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的損害，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)可誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)。BDNF、NGF、⑶NF對(duì)體外壓力作用下的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用?？傊壳盎瘜W(xué)因素對(duì)iPS定向分化誘導(dǎo)的神經(jīng)元主要為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元。而將人iPSCs源性3D視網(wǎng)膜利用化學(xué)因子將其特異分化為RGCs的研究還未見(jiàn)明確的報(bào)道。由于RGC是視網(wǎng)膜重要組成部分，將人iPSCs源性3D視網(wǎng)膜定向分化為功能性RGCs無(wú)論對(duì)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究還是眼科學(xué)臨床治療都具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0004]發(fā)育生物學(xué)研究表明，無(wú)論是低等還是高等的動(dòng)物，其視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性變化均需要精確的時(shí)間和空間的調(diào)控，從視泡、視杯發(fā)育到神經(jīng)視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮的分化進(jìn)一步發(fā)育分化成為精細(xì)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。因此認(rèn)為RGCs的發(fā)育與成熟除了化學(xué)因素影響外，精細(xì)的時(shí)空調(diào)控也是必不可少的重要誘導(dǎo)條件。由于RGCs在視覺(jué)信號(hào)的傳入、視覺(jué)信息的傳導(dǎo)完整以及視功能維持等方面均具有重要的作用，其損傷后較難以通過(guò)其它方式進(jìn)行替代。因此，視覺(jué)神經(jīng)損傷后恢復(fù)RGCs的數(shù)目和功能不僅有助于減緩視神經(jīng)損傷病人病情的惡化，促進(jìn)患者視覺(jué)功能的恢復(fù)，也必將促進(jìn)損傷視神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的重建，對(duì)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)以及神經(jīng)組織工程學(xué)的研究也會(huì)產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]為了克服現(xiàn)有種子細(xì)胞來(lái)源誘導(dǎo)功能低下的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種體外誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的方法。
[0006]本發(fā)明的誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，包括以下步驟:將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞，以該單細(xì)胞作為種子細(xì)胞接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bFGF、CNTF, BDNF)和維持濃度的視網(wǎng)膜分化營(yíng)養(yǎng)液(RDM)組成的培養(yǎng)基。
[0007]所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基優(yōu)選為:每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement lng、非必須氨基酉愛(ài)(essential media-non essential amino acidsNEAAs) lng、肝素2 μ g，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基，所述的DMEM/F12培養(yǎng)基是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按照體積比1:1混合而成。
[0008]bFGF為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，CNTF為親膽喊能神經(jīng)元因子，N2supplement 為 N2 添加劑，essential media-non essential aminoacids (NEAAs)為非必須氨基酸，heparin為肝素，它們都是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)。
[0009]所述的將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞優(yōu)選為將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，分離組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分，保留金黃色的組織部分的神經(jīng)纖維層，將分離的神經(jīng)纖維層組織用PBS沖洗，吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞團(tuán)成單細(xì)胞后加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化，混懸液離心去上清后，得到種子細(xì)胞。
[0010]所述的培養(yǎng)優(yōu)選是在37°C、5% C02，飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)前期已成功將人源性的iPSc細(xì)胞誘導(dǎo)分化為人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜(Xiufeng Zhong, et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissue withfunct1nal photoreceptors from human iPSCs, Nat Commun.2014Jun 10 ;5:4047)。本發(fā)明中首先將該人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜組織神經(jīng)纖維層機(jī)械分離消化為單細(xì)胞，以其作為種子細(xì)胞接種于含特定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bFGF、CNTF, BDNF)的無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境中，通過(guò)時(shí)間調(diào)控和化學(xué)因子共同作用，將種子細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為功能性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)。本發(fā)明不僅對(duì)視神經(jīng)損傷的救治與功能康復(fù)有重要的理論和實(shí)際意義，而且對(duì)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)組織工程中種子細(xì)胞的研究也有積極的推動(dòng)作用。
[0012]本發(fā)明從干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的角度提供了獲得一種功能性RGCs新的研究途徑，為人iPSc-RGCs的定向分化提供了一種新的研究思路，為探討人iPSc-RGCs的調(diào)控機(jī)制提供了新的研究線索，為神經(jīng)組織工程的研究提供了一種新的種子細(xì)胞，并為干細(xì)胞移植治療視覺(jué)損傷奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
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[0013]圖1是不同時(shí)間誘導(dǎo)分化下RGC細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)情況，分化的RGCs軸突隨時(shí)間變化而增長(zhǎng)，其培養(yǎng)7天軸突長(zhǎng)度為169.02-322.05 μπι(Α)，14天后軸突長(zhǎng)度為170.35-369.21 μπι(Β)，21 天軸突長(zhǎng)度為 269.28-508.87 ym(C)；
[0014]圖2是RGC細(xì)胞生長(zhǎng)14天后的細(xì)胞抗體Brn3b (A)，Tubulin (B)及Nestin(C)免疫熒光染色；
[0015]圖3是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)細(xì)胞生長(zhǎng)21天后細(xì)胞軸突蛋白(NFH)免疫熒光染色；
[0016]圖4是RGC細(xì)胞生長(zhǎng)21天后細(xì)胞鈉離子通道蛋白(Nav1.6)免疫熒光染色
[0017]圖5是應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)RGC細(xì)胞的動(dòng)作電位結(jié)果，其中A為RGC細(xì)胞動(dòng)作電位，B為使用河豚毒素干擾RGC細(xì)胞后動(dòng)作電位下降，洗脫毒素后動(dòng)作電位恢復(fù)。
【具體實(shí)施方式】
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[0018]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。