一種谷氨酸脫羧酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種谷氨酸脫羧酶及其編碼基因和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricEtcidy-ciminobutcinoic￡icid，間矛爾GABA) 一種功能性氨基酸，廣泛分布于動植物及微生物中的一種非蛋白氨基酸，是存在于哺乳動 物腦、脊髓中的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，對生物體生命活動起著不可替代的作用。GABA具有延 緩衰老、降血壓、調(diào)節(jié)激素分泌、治療癲癇、治療帕金森病的功能。此外GABA作為中樞神經(jīng) 系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，還可以鎮(zhèn)痛、保肝、活腎、解酒毒、抗腦缺血、抗焦慮、 抗心律失調(diào)、治療哮喘、調(diào)節(jié)胃酸分泌等功能。2009年9月27日，衛(wèi)生部批準(zhǔn)GABA為新資 源食品，作為新資源食品的GABA，由于化學(xué)合成GABA存在較大的安全性問題，不適合應(yīng)用 于食品的開發(fā)。因此，利用生物合成法生產(chǎn)GABA是一條相對安全與有效的途徑。
[0003] 目前生物合成法生產(chǎn)GABA均采用微生物技術(shù)，通過篩選優(yōu)良高產(chǎn)的安全菌種，發(fā) 酵生產(chǎn)GABA，主要利用的是微生物中自身所含有GABA合成基因。然而利用植物來源的GABA 合成基因生物合成GABA相對很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中植物來源的GABA合成基因種類少、合成GABA效 率低的不足，提供一種植物來源的、能高效催化合成GABA的谷氨酸脫羧酶及其編碼基因和 應(yīng)用。
[0005] 申請人研究發(fā)現(xiàn)與其他植物相比，厭氧脅迫處理的茶（Camelliasinensis)葉具 有產(chǎn)生高含量GABA的能力，并從茶葉中篩選出了具有高效轉(zhuǎn)化形成GABA的谷氨酸脫羧酶 基因CsGAD，此外還發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶CsGAD的C端序列會抑制其轉(zhuǎn)化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脫羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脫羧酶CsGADm)能進(jìn)一步提高其 生物合成形成GABA的轉(zhuǎn)化率，并最終獲得基于植物源基因生物合成形成的GABA。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種谷氨酸脫羧酶CsGAD，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示，其含有493個氨基酸殘基。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述的谷氨酸脫羧酶CsGAD的谷氨酸脫羧 酶基因CsGAD。
[0008] 優(yōu)選，所述的谷氨酸脫羧酶基因CsGAD的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其含有 1482bp的堿基。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種谷氨酸脫羧酶CsGADm，其氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，其含有462個氨基酸殘基。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種編碼所述的谷氨酸脫羧酶CsGADm的谷氨酸脫羧 酶基因CsGADm。
[0011] 優(yōu)選，所述的谷氨酸脫羧酶基因CsGADm的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，其含 有1389bp的堿基。
[0012] 本發(fā)明的第五個目的是提供所述的谷氨酸脫羧酶CsGAD和/或谷氨酸脫羧酶 CsGADm在催化生成γ-氨基丁酸（GABA)中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明利用序列敲除方法，改造了谷氨酸脫羧酶CsGAD。對谷氨酸脫羧酶CsGAD 的修飾是通過切除谷氨酸脫羧酶CsGAD的C端的31個氨基酸序列而得到谷氨酸脫羧酶 CsGADm，谷氨酸脫羧酶CsGADm的編碼基因即谷氨酸脫羧酶基因CsGADm對應(yīng)為切除了谷氨 酸脫羧酶基因CsGAD的3'端的93bp核苷酸后得到的序列。本發(fā)明的谷氨酸脫羧酶CsGAD 具有較高的催化活性，達(dá)〇. 99±0. 09mgGABA/mgprotein/min，谷氨酸脫羧酶CsGADm的催 化活性更是大大提高，達(dá)1. 67±0. 34mgGABA/mgprotein/min。每50ml經(jīng)異丙基-β-D-硫 代半乳糖苷誘導(dǎo)培養(yǎng)的含有重組質(zhì)粒pET-32a_CsGADm的EscherichiacoliRosetta重組 菌菌液可產(chǎn)生24. 2mg重組谷氨酸脫羧酶CsGADm蛋白，lmg重組谷氨酸脫羧酶CsGADm蛋白 151^11可完成轉(zhuǎn)化35.2811^1^-谷氨酸全部生成6484，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。本發(fā)明利用植物來 源的谷氨酸脫羧酶生物合成生產(chǎn)γ-氨基丁酸，具有來源安全、工藝簡單、轉(zhuǎn)化時間快、轉(zhuǎn) 化率高等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1是重組谷氨酸脫羧酶CsGADm純化蛋白的SDS-page結(jié)果，Marker的單位為 KDa〇
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0016] 實(shí)施例1:
[0017] 申請人研究發(fā)現(xiàn)與其他植物相比，厭氧脅迫處理的茶（Camelliasinensis)葉具 有產(chǎn)生高含量GABA的能力，并從茶葉中篩選出了具有高效轉(zhuǎn)化形成GABA的谷氨酸脫羧酶 基因CsGAD，此外還發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶CsGAD的C端序列會抑制其轉(zhuǎn)化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脫羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脫羧酶CsGADm)能進(jìn)一步提高其 生物合成形成GABA的轉(zhuǎn)化率。
[0018] 以下對實(shí)施的具體步驟進(jìn)行說明：
[0019]a)茶葉RNA的提取及cDNA的獲得：
[0020] RNA提取用華越洋的超快型植物RNA提取試劑盒GK系列。具體步驟為：取0. 05g用 液氮磨碎的茶（Camelliasinensis)葉加入0. 5ml裂解液，混勾，加入150μ1去蛋白液（取 下層），加入100μ1氯仿，混勾30s，離心（12000Xg)5min，取上清350μ1，加入等體積漂洗 液，顛倒混勻，分兩次上柱，離心（12000Xg) 30s，加入500μ1洗柱液，離心（12000Xg) 30s， 重復(fù)洗柱步驟，再次離心（12000Xg)lmin，將柱移至新離心管中，加50μ1水，室溫靜置 3min，離心（12000Xg)lmin，提取得到茶葉RNA，保存于_80°C。
[0021] 將茶葉RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用TAKARA公司的PrimeScript?RTreagentKitwith gDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒。取出-80°C凍存的茶葉RNA，待融化后，根據(jù)說 明書加入DNA酶后，42°C2min消化DNA，再加入反轉(zhuǎn)錄試劑，37°C15min，85°C5sec;得到逆 轉(zhuǎn)錄的cDNA。
[0022] b)谷氨酸脫羧酶基因CsGAD和修飾后的谷氨酸脫羧酶基因CsGAD(谷氨酸脫羧酶 基因
[0023] CsGADm)的克隆：
[0024] 利用生物信息學(xué)分析方法，根據(jù)已知的谷氨酸脫羧酶基因序列，設(shè)計用于擴(kuò)增谷 氨酸脫羧酶基因CsGAD的引物序列為：F: 5' -GCGGCCGCATGGTTCTGTCAAAGACAACATCG-3' ； R:5' -GTCGACTTAGCAAACACCATTAGTCTTCTT-3'。反應(yīng)體系參照說明書，PCR擴(kuò)增用Takara 的PrimeSTARMaxPremix(2X)10yl，F(xiàn)和R引物各ΙΟμΜ，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板(λΙμL， 加雙蒸水補(bǔ)足20μ1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8°C30sec，l個循環(huán)；98°C15sec，55°C15sec， 72°C30sec，33個循環(huán)；72°ClOsec，1個循環(huán)。由此擴(kuò)增得到谷氨酸脫羧酶基因CsGAD全長 序列，把全長序列克隆連接到表達(dá)載體pET-32a(含有His標(biāo)簽，Novage