一種cyp2c19*2和cyp2c19*3檢測引物及其檢測體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種CYP2C19*2和 CYP2C19*3檢測引物及其檢測體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人體中，CYP2C19參與氯吡格雷、S-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去 甲安定等藥物的代謝。CYP2C19遺傳變異可導(dǎo)致酶活性的個體差異，使人群出現(xiàn)超快代 謝者（ultrarapidmetabolizer，UM)、快代謝者（extensivemetabolizer，EM)、中間代 謝者（intermediatemetabolizer，IM)和慢代謝者（poormetabolizer，PM)4 種表型。 CYP2C19*2(rs4244285，c. 681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c. 636G>A)是中國人群中存在 的2種導(dǎo)致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。EM個體只攜帶CYP2C19*1等位基因，頂個體 攜帶CYP2C19*2 或CYP2C19*3 雜合子基因型；PM個體攜帶CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3 和 CYP2C19*3/*3 基因型。
[0003] 氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于急性冠脈綜合征、缺血性腦血栓、閉塞性 脈管炎和動脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。心臟支架手術(shù)后的患者需長期服用氯吡格雷 以防止支架內(nèi)再梗。氯吡格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)。CYP2C19PM 患者應(yīng)用常規(guī)劑量的氯吡格雷后體內(nèi)活性代謝物生產(chǎn)減少，對血小板的抑制作用下降。美 國FDA和美國心臟病學(xué)會建議，對于CYP2C19PM患者需考慮改變治療方案。
[0004] 阿米替林為三環(huán)類抗抑郁藥，主要用于焦慮性或激動性抑郁癥的治療。阿米替林 在體內(nèi)主要經(jīng)CYP2C19代謝為活性代謝產(chǎn)物去甲替林。CYP2C19活性的高低可通過影響血 液中阿米替林與去甲替林的濃度比，影響阿米替林的療效和不良反應(yīng)的產(chǎn)生。
[0005] 伏立康唑是一種廣譜三唑類抗真菌藥，CYP2C19是其主要代謝酶之一。CYP2C19EM 與PM個體間伏立康唑的血液濃度存在顯著差異，PM個體在應(yīng)用常規(guī)劑量藥物時可能出現(xiàn) 毒副反應(yīng)，建議減少用藥劑量；EM和IM個體可給予常規(guī)劑量。在常規(guī)劑量治療時，若EM個 體出現(xiàn)毒副反應(yīng)或PM療效不佳，均應(yīng)考慮更換藥物。FDA批準(zhǔn)的藥物說明書中指出應(yīng)用伏 立康唑前需檢測CYP2C19基因型，以確保用藥安全。
[0006] 由上述可見，CYP2C19的活性在在臨床指導(dǎo)用藥上具有非常廣泛的作用，因此， CYP2C19*2和CYP2C19*3的檢測也是非常重要。目前用于檢測這兩種亞型的方法主要是直 接測序法、Taqman熒光PCR法以及芯片法等等，這些方法均在不同方面展現(xiàn)出了自己的優(yōu) 勢，但是也都普遍存在檢測儀器及配套試劑耗材購買成本高昂，檢測周期長、操作繁瑣且假 陽性率時有出現(xiàn)的問題。因此，發(fā)明并構(gòu)建一套價格低廉，使用操作簡便且利于臨床檢驗大 范圍普及的檢測引物及檢測體系就顯得十分重要。
[0007]突變擴增系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)又稱等位基 因特異性擴增法（allelespecificamplification,ASA)，是Newton等首先建立用來檢測 已知突變的方法。其基本原理是，如果引物的3'端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱 DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點突變設(shè)計2條引物，其3'端堿基分別與突變和正常 的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。此法已用于多種疾病 的點突變的檢測。因此，使用ARMS技術(shù)與PCR技術(shù)相配合，利用二者的優(yōu)勢檢測CYP2C19 基因型、指導(dǎo)臨床用藥很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的檢測CYP2C19基因型的方法成本較高，操作復(fù)雜， 需要的測試時間長。
[0009] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3檢測引物，其特征在 于：包括以下引物：
[0010] 5' -ATTACAACCAGAGCTTGGCA-3，（SEQIDNo. 1，以下簡稱P2)
[0011] 5' -ACTGGAAGCTGCAGAACAGA-3，（SEQIDNo. 2,以下簡稱Q2)
[0012] 5' -CCCACTATCATTGATTATTTCACG-3，（SEQIDNo. 3,以下簡稱F2)
[0013] 5 ' -TTAAGTAATTTGTTATGGGTTACT-3，（SEQIDNo. 4,以下簡稱R2)
[0014] 5 ' -ACCAGCTAGGCTGTAATTGTTA-3，（SEQIDNo. 5,以下簡稱P3)
[0015] 5 ' -TGGGCTTAGAAGCCTGATCTAT-3 '（SEQIDNo. 6,以下簡稱Q3)
[0016] 5' -GATTGTAAGCACCCCCGGA-3，（SEQIDNo. 7,以下簡稱F3)
[0017] 5 ' -ACTTGGCCTTACCTGGCTC-3 '（SEQIDNo. 8,以下簡稱R3)。
[0018] 進一步地，所述P2、Q2、F2和R2為檢測CYP2C19*2的引物，P3、Q3、F3和R3為檢 測CYP2C19*3的引物。
[0019] 其中，引物P2和Q2是針對CYP2C19設(shè)計的特異引物，P2、Q2的產(chǎn)物為一長度為 537bp的核酸片段。引物F和R是針對rs4244285位點的等位基因設(shè)計的特異性引物，F(xiàn)2 對應(yīng)G等位基因，R2對應(yīng)A等位基因。P3和Q3是針對CYP2C19設(shè)計的特異引物，P3Q3的 產(chǎn)物為一長度為578bp的核酸片段。引物F和R是針對rs4986893位點的等位基因設(shè)計的 特異性引物，F(xiàn)3對應(yīng)A等位基因，R3對應(yīng)G等位基因。為進一步降低可能的非特異性擴增， 本發(fā)明又人為地在F2和R2引物:V端倒數(shù)第三位引進入一個突變堿基，在F3和R3引物 3'端倒數(shù)第三位引進入一個突變堿基。
[0020] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3的檢測體系，包括上 述的引物，還包括PCR緩沖液，Taq酶和dNTP。
[0021] 進一步地，所述檢測體系包括檢驗CYP2C19*2的體系A(chǔ)和檢驗CYP2C19*3的體系 8。所述體系4包括？2、〇242、1?2、緩沖液439酶和(1犯13。所述體系8包括？3、〇3、？3、1?3、 緩沖液，Taq酶和dNTP。
[0022] 優(yōu)選地，所述體系A(chǔ)與體系B中各引物的濃度相同，均為200μΜ。
[0023] 優(yōu)選地，所述體系Α與體系Β中dNTP濃度相同，為100μΜ。
[0024] 優(yōu)選地，所述體系Α與體系Β中Taq酶的濃度相同，為50U/mL。
[0025] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3的檢測方法，其使用 上述的檢測體系，包括以下步驟：
[0026] (l)PCR反應(yīng)
[0027] 以待檢測的核酸為模板，分別加入到體系A(chǔ)和體系B中，對CYP2C19位點進行PCR 處理，得到的產(chǎn)物分別記為PA和PB;
[0028] (2)電泳
[0029] 將步驟⑴中得到的PA和PB分別進行凝膠電泳，將得到的電泳圖與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn) 進行對照。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中體系A(chǔ)和體系B進行PCR處理的條件相同，為：（a)95°C下 3min；
[0031] (b)95°C下 15s，55°C下 15s，72°C下 20s，循環(huán) 35 次。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，模板在體系A(chǔ)和體系B中的濃度相同，為0. 8~4ng/yL。
[0033] 優(yōu)選地，步驟（2)中PA和PB進行電泳的條件相同，為：取步驟（1)中得到PA和PB 各5μL，分別用2 %的瓊脂糖凝膠經(jīng)染色后在6v/cm電壓下電泳30min。
[0034] 本發(fā)明在ARMS-PCR的基礎(chǔ)上采用雙向擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Bi-Amplification RefractoryMutationSystemPCR，BI-ARMS-PCR)技術(shù)，設(shè)計出檢驗CYP2C19*2 和 CYP2C19*3的引物及體系。分別針對rs4244285的兩個等位基因和rs4986893的兩個等位 基因設(shè)計特異性引物，通過讀取電泳的條帶個數(shù)及大小來判定待測樣本中的rs4244285和 rs4986893位點的堿基，從而判斷被測試者是否攜帶CYP3A5*2和/或CYP3A5*2,指導(dǎo)被測 試者用藥。
[0035] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：
[0036] (1)本發(fā)明提供的試劑盒檢測成本低：無需DNA測序儀，僅需普通熱循環(huán)儀和普通 的瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備即可開展檢測，有利于推廣至地方醫(yī)院檢測或者普通實驗室進行科 研工作。
[0037] (2)本試劑盒操作簡便、測試時間短無需PCR產(chǎn)物純化、測序引物設(shè)計、測序反應(yīng) PCR的純化、測序反應(yīng)化學(xué)類型選擇等步驟，只需要PCR和電泳的這兩個操作步驟，簡便易 行。現(xiàn)有的基因測序法最快也要八個小時，而本發(fā)明從DNA提取到基因分型完成，僅需2個 小時的時間，較好地縮短了檢測時間。
【附圖說明】
[0038] 圖1是檢測樣本1-4經(jīng)檢測體系A(chǔ)PCR得到的產(chǎn)物（PA^PAJ的電泳圖。
[0039] 圖2為檢測樣本1-4經(jīng)檢測體系BPCR得到的產(chǎn)物的電泳圖。
[0040] 圖3-圖6分別是檢測樣本l-4rs4244285位點的DNA測序圖。
[0041] 圖7是檢測樣本l-3rs4986893位點的DNA測序圖（由上至下依次為1、2、3)。