人TWIST1/Vimentin基因甲基化檢測標(biāo)志物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人TWISTI/Vimentin基因甲基化檢測標(biāo)志物 及試劑盒
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全 身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于 前列腺癌，居第2位。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6. 61/10萬，列惡性腫 瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童。其發(fā)病率隨年齡增長而增加， 高發(fā)年齡50~70歲。男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3~4倍。臨床上膀胱癌具有惡性程度 高、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等特點，因此早期診斷對治療和預(yù)防復(fù)發(fā)有著非常重要的意義，可以增加 保留膀脫的機(jī)會并提尚患者總體生存率。
[0003] 眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因作用的多階段過程。大量研究表明， 有一套特定基因的改變導(dǎo)致并推動了癌癥的發(fā)生發(fā)展：染色體不穩(wěn)定性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、 表觀遺傳學(xué)改變等。表觀遺傳是指不涉及基因組DNA序列改變而在細(xì)胞分裂過程中可以 遺傳給子代細(xì)胞的基因組修飾作用，目前最為人們所知的表觀遺傳學(xué)主要方式是DNA甲基 化。由于DNA甲基化往往發(fā)生在膀胱癌發(fā)生過程中的早期，很容易在患者的尿液中檢測到。 因此，檢測尿液中DNA甲基化狀態(tài)有望成為膀胱癌早期無創(chuàng)診斷的一條新途徑。
[0004] 膀胱癌DNA分子甲基化檢測組合物一直以來都沒有其特有的基因，多數(shù)研究是聯(lián) 合幾個基因同時檢測尿液中基因甲基化水平，以此來提高靈敏度與特異性。根據(jù)最新的文 獻(xiàn)報道，研究人員已經(jīng)通過大規(guī)模的基因篩選和樣本測序，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌發(fā)生早期尿液脫 落細(xì)胞中1-2個基因的甲基化概率明顯增加，這為膀胱癌早期輔助診斷提供了可靠的檢測 標(biāo)志物。
[0005] TWIST1是堿性的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其mRNA在胎盤 組織表達(dá)量最高，在胚胎發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。它參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控，進(jìn) 而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性腫瘤中常見TWIST1過表達(dá)或啟動子的甲基化。目前國 內(nèi)外涉及膀胱腫瘤與TWIST1基因的相關(guān)性研究包括，TWIST1蛋白表達(dá)與腫瘤的相關(guān)性分 析，以及尿液標(biāo)本甲基化水平檢測。IsabelleRenard等人研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌尿液樣本中 TWIST1甲基化的檢出率達(dá)到88%，特異性達(dá)到94%。
[0006] Vimentin是中間絲纖維蛋白家族的一員，在很多方面表現(xiàn)出復(fù)雜的基因表達(dá)模 式，主要表達(dá)于胚胎組織和來源于間葉組織的成體細(xì)胞。越來越多的研究表明，Vimentin 的表達(dá)不再是間充質(zhì)起源細(xì)胞、向間葉分化的腫瘤細(xì)胞的特異性生物標(biāo)志，它也在乳腺癌、 膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等上皮源性惡性腫瘤中共同表達(dá)，而且與癌細(xì)胞的侵襲性強(qiáng)和易轉(zhuǎn)移 密切相關(guān)。另有研究證實，與腫瘤癌前病變（如腺瘤）產(chǎn)生相關(guān)的Vimentin的表達(dá)下調(diào)可 能與其啟動子的甲基化密切相關(guān)，這提示DNA甲基化可以從基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Vimentin表 達(dá)，其對于腫瘤細(xì)胞迀移具有促進(jìn)作用。
[0007]目前，膀胱鏡檢查、對可疑病變組織進(jìn)行活檢以及對尿液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查仍然是 膀胱腫瘤臨床最常用的診斷和隨訪方法。然而，膀胱鏡檢查是一種侵入性且昂貴的檢查方 法，給患者帶來痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；尿液細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度不高，陽性率較低，給臨床應(yīng)用 帶來不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單快速、無創(chuàng)傷的膀胱癌檢測標(biāo)志物以及試劑 盒，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測成本低、取材方便、樣本易存放和無創(chuàng)傷性等優(yōu)點。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測標(biāo) 志物，所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測標(biāo)志物包括TWISTl、Vimentin和ACTB三種 基因的甲基化引物和探針；
[0010] 所述三種基因的甲基化引物和探針的序列分別是：
[0011]
[0012] 〇
[0013] 本發(fā)明還提供一種人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所 述人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測試劑盒包括：
[0014] 提取試劑：尿液保存液、尿液漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗脫液；
[0015] 硫化純化試劑：硫化試劑、DNA保護(hù)液、結(jié)合液、磁珠、純化漂洗液1、純化漂洗液2、 純化漂洗液3、洗脫液；
[0016]PCR檢測試劑：TWIST1PCRMix、VimentinPCRMix、ACTBPCRMix、陰性質(zhì)控品、陽 性質(zhì)控品、聚合酶。
[0017] 所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測試劑盒用于檢測時的PCR程序如下：首 先95 °C變性5分鐘，然后95 °C變性20秒、62 °C退火40秒，并進(jìn)行45次循環(huán)，PCR循環(huán)過程 中，儀器升降溫速度設(shè)定為1. 3°C/S，最后40°C維持30秒。
[0018]所述PCR結(jié)果在LighiCycier?.480II上進(jìn)行TWISTl/Vimentin/ACTB的Cp值分 析，根據(jù)空白對照組、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、待測樣品的擴(kuò)增情況，確定試驗結(jié)果的有效 性并對樣本結(jié)果進(jìn)行判讀。
[0019] 所述PCR結(jié)果的分析具體如下：
[0020] 1)在LjghtCycIcrQD48〇基本軟件模塊欄中選擇"Analysis Overview"；
[0021] 2)選擇"AbsQuant/2ndDerivativeMax" 分析模式；
[0022] 3)選擇"FilterComb465-510" ；
[0023] 4)點擊"Calculate"，軟件自動給出目的基因TWISTl/Vimentin的Cp值；
[0024] 5)選擇"FilterComb533-580" ；
[0025] 6)點擊"Calculate"，軟件自動給出內(nèi)參基因ACTB的Cp值。
[0026] 所述PCR結(jié)果的具體判讀如下表：
[0027] 若判讀結(jié)果為陰性，患膀胱癌風(fēng)險性較低；若判讀結(jié)果為陽性，患膀胱癌風(fēng)險較 高，建議鏡檢確認(rèn)。
[0028]
[0029] 本試劑盒采用熒光PCR法檢測膀胱癌尿液脫落細(xì)胞基因甲基化指標(biāo)。將待測DNA 樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模板對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對檢測基因和內(nèi)參基因進(jìn) 行雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)。通過對所述待測DNA樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模板對照的 參數(shù)范圍的判讀，判斷所述待測DNA樣品的檢測基因的甲基化情況。
[0030] 本發(fā)明選擇TWIST1和Vimentin兩個基因中的標(biāo)志片段進(jìn)行膀胱癌檢測，未見于 任何報道，將其作為檢測標(biāo)志物，靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明組合物首次建立TWIST1和 Vimentin雙基因聯(lián)合檢測膀胱癌尿液脫落細(xì)胞基因甲基化體系，不僅可以用于膀胱癌早期 診斷，還可以預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)。
[0031] 本發(fā)明在較少樣本體積（5mL)下進(jìn)行，依然可得到相同水平的靈敏度和特異性， 可適用于小體積樣本的檢測。
[0032] 采用本發(fā)明檢測膀胱癌尿液中TWIST1與Vimentin甲基化情況，具有操作簡單、快 速、靈敏度高，特異性好，無創(chuàng)傷等優(yōu)點，適合于復(fù)發(fā)率很高的膀胱癌的早期診斷與隨訪，使 需定期進(jìn)行膀胱鏡檢查的患者數(shù)量明顯減少，具有很高的臨床應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0034] 實施例
[0035] 1、人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測體系
[0036] 樣本：人尿液樣本、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品以及空白對照樣本；
[0037] 儀器：Lightcycler480、高速離心機(jī)、金屬浴、PCR儀、漩渦震蕩儀等；
[0038]TWIST1、Vimentin和ACTB三個基因的甲基化引物和探針如下所示：
[0041] 2、人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測試劑盒
[0042] 2. 1根據(jù)確定的反應(yīng)體系建立的人TWISTl/Vimentin基因提取試劑，具體組分如 下：
[0043]
[0044] 注：*表示粉末，需加入相應(yīng)體積的溶劑溶解后才能使用；**表示濃縮液，需加入 相應(yīng)體積的無水乙醇才能使用
[0045] 2. 2根據(jù)確定的反應(yīng)體系建立的人TWISTl/Vimentin基因硫化純化試劑，具體組 分如下：

[0048] 注：*表示粉末，需加入相應(yīng)體積的溶劑溶解后才能使用；**表示濃縮液，需加入 相應(yīng)體積的無水乙醇才能使用
[0049] 2. 3根據(jù)確定的反應(yīng)體系建立的人TWISTl/Vimentin基因PCR檢測試劑，具體組分 如下：
[0050]
[0051]
[0052] 2. 4根據(jù)確定的反應(yīng)體系建立的人TWISTl/Vimentin基因質(zhì)控品試劑，具體組分 如下：
[0053]
[0054] 3、人TWISTl/Vimentin基因甲基化檢測試劑盒檢測過程
[0055] 3. 1、人TWISTl/Vimentin基因DNA提取
[0056] a)試劑準(zhǔn)備
[0057] 提取漂洗液：初次使用前加入12mL無水乙醇，振蕩混勻。
[0058] b)提取步驟
[0059]3. 1. 1取一支15mL離心管（自備），加入5mL尿液樣本，3500rpm離心lOmin，棄掉 上清，保留沉淀；
[0060] 3. 1. 2尿沉淀用500yLPBS(4°C預(yù)冷）懸浮分裝到1. 5mL離心管中，3500rpm離心 5min(4°C)，棄掉上清；
[0061] 3. 1. 3 重復(fù) 1 次步驟 3. 1. 2;
[0062] 3. 1. 4尿沉渣用500μLPBS重懸，加入750μL裂解液，顛倒混勻15次，渦旋震蕩 lmin；
[0063] 3. 1. 5將上述混合液轉(zhuǎn)入到已裝入收集管的吸附柱中，lOOOOrpm離心lmin，倒掉 收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重復(fù)操作，將剩余混合液轉(zhuǎn)入吸附柱；
[0064] 3. 1. 6向吸附柱中加入500μL的提取漂洗液，lOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
[0065] 3. 1. 7向吸附柱中加入500μL的85%乙醇（自備），lOOOOrpm離心lmin，倒掉收 集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
[0066] 3. 1. 8重復(fù)1次步驟3. 1. 7 ;
[0067] 3. 1. 912000rpm空離2min，徹底去除殘余的乙醇，以免其影響后續(xù)