一種信號肽及其在利用淀粉產(chǎn)l-精氨酸重組菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 利用一種信號肽使重組菌高效分泌特定酶代謝廉價碳源進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)的方法 和高效生產(chǎn)某種蛋白的方法，屬于基因工程、蛋白質(zhì)與酶工程和代謝工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉，作為微生物工業(yè)碳源的主要來源，一般需要經(jīng)過液化和糖化兩個階段才能 為微生物所利用。能直接利用淀粉作為碳源的微生物主要有鏈霉菌屬、解淀粉芽孢桿菌及 各種霉菌，而大部分用于生產(chǎn)的菌種無法直接利用淀粉作為碳源?，F(xiàn)國內(nèi)外已有報道，改造 釀酒酵母直接以淀粉為碳源生產(chǎn)乙醇，導(dǎo)入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒狀桿菌利用可溶性 生產(chǎn)L-賴氨酸的相關(guān)報道。
[0003] 發(fā)明人前期工作已獲得通過相關(guān)基因工程和代謝工程技術(shù)改造的高產(chǎn)L-精氨酸 的菌種：鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890(已在專利CN03112896. 3中公開）。
[0004] 發(fā)明人獲得的高產(chǎn)L-精氨酸的菌種只能以葡萄糖為主要碳源發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨 酸，不能直接利用淀粉作為主要碳源。
[0005] L-精氨酸作為半必需氨基酸，在醫(yī)藥工業(yè)，保健品、食品等領(lǐng)域皆有廣泛的應(yīng)用。 通過基因工程和代謝工程技術(shù)進(jìn)一步改造高產(chǎn)L-精氨酸菌種，使其能利用淀粉作為碳源 發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。對簡化L-精氨酸生產(chǎn)工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本有一定的參考應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過基因工程技術(shù)將去除自身信號肽的α-淀粉酶基因與來源谷氨酸棒 狀桿菌和枯草芽孢桿菌的Sec和Tat兩個主要分泌途徑的十二條信號肽分別融合，并比 對α_淀粉酶在L-精氨酸尚廣菌種中的分泌效果，得到β-甘露聚糖基因的彳目號肽 MannaseSignalPeptide(MSP)為分泌胞外酶效果較好的一種新發(fā)現(xiàn)信號肽。
[0007] 所述MSP核苷酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0008] 本發(fā)明在已有高產(chǎn)L-精氨酸菌種的基礎(chǔ)上，通過基因工程技術(shù)將β-甘露聚糖基 因的信號肽融合到去掉自身信號肽的α-淀粉酶基因，構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入到L-精氨酸高產(chǎn) 菌中，并成功表達(dá)。使其能以可溶性淀粉和葡萄糖作為混合碳源進(jìn)行L-精氨酸發(fā)酵。
[0009] 所述高產(chǎn)L-精氨酸菌種為本研究室前期構(gòu)建的鈍齒棒狀桿菌CGMCCΝ0. 0890。
[0010] 本發(fā)明構(gòu)建的重組菌鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890/pMSPamy經(jīng)優(yōu)化在50g/L可溶 性淀粉和l〇〇g/L葡萄糖做為混合碳源的5L發(fā)酵罐中發(fā)酵96h，L-精氨酸產(chǎn)量為48 ± 0. 7g/ L，其中發(fā)酵液α-淀粉酶的酶活為2126± 12. 4U/mL。
[0011] 所述的技術(shù)方案：
[0012] 1.根據(jù)NCBI上公布的相關(guān)基因序列設(shè)計信號肽和目的基因融合引物。
[0013] 2.重組菌的構(gòu)建
[0014] 從相關(guān)菌種中抽提染色體DNA為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò) 增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢 驗回收產(chǎn)物的濃度。用相同的限制性內(nèi)切酶對相關(guān)表達(dá)載體和純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶 切，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并用凝膠回收試劑盒對其回收，并用超微量分光光 度計檢測其濃度。將酶切后的載體和PCR產(chǎn)物按一定比例混合，在T4DNA連接酶的作用下 過夜連接。將連接產(chǎn)物用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliBL21，獲得含重組質(zhì)粒的E.coliBL21。 提取質(zhì)粒，通過單雙酶切及PCR驗證后用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入相關(guān)菌種中。最后，將 含15%甘油的重組菌液保存-70°C冰箱。
[0015] 3.重組菌的產(chǎn)酸培養(yǎng)
[0016] 將重組菌接種于新鮮的LB+0. 5%Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1 %。 次日以1%轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（底物為可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mMIPTG誘導(dǎo)表 達(dá)，生長后期收集發(fā)酵液利用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸含量（L-精氨酸及相關(guān)氨基 酸等）。發(fā)酵培養(yǎng)基具備微生物生長所需的營養(yǎng)成分，并通過相關(guān)優(yōu)化。
[0017] 4.重組菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0018] 將重組菌接種于新鮮的LB+0. 5%Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1 %。 次日以1 %轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（底物為葡萄糖），0. 8mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，生長后期收集發(fā) 酵液測其酶活和蛋白含量。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 :信號肽引物與α-淀粉酶串聯(lián)的引物設(shè)計
[0020] 根據(jù)NCBI上公布的相關(guān)基因序列和α-amyase基因序列設(shè)計信號肽和基因串聯(lián) 的大片段引物。
[0021] Pl:pMSPamyHindIIIF
[0025] 實施例2 : α-淀粉酶基因的信號肽替換及其克隆
[0026] [1]從Str印tomyces kathiraeCCTCCM201?32提取染色體作為模板DNA。
[0027] [2]根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的α-淀粉酶基因序列設(shè)計信號肽和基因串聯(lián)的PCR引 物。以Str印tomyceskathiraeCCTCCΜ2012432的基因組為模板利用大片段引物PCR，得 到帶有經(jīng)密碼優(yōu)化的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示Mannasesignalpeptide(簡稱MSP) 信號肽的α-淀粉酶基因。PCR擴(kuò)增體系（50μL):模板1μL，上下游引物各0. 5μL，dNTP Mix4yL，10XExTaqBuffer5yL，滅菌ddH20 38.5yL，ExTaqDNA聚合酶 0.5yL。 PCR反應(yīng)條件：94 °C預(yù)變性，5min，一個循環(huán)；94 °C變性，30s，56 °C退火，30s，72 °C延伸， lmin30s，30個循環(huán)；72°C，10min，一個循環(huán)；4°C，10min，一個循環(huán)（其中退火溫度和延伸時 間根據(jù)不同引物和基因進(jìn)行相對的調(diào)節(jié)）。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回 收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1. 5mL的離心管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 實施例3:重組質(zhì)粒pXMJ19_MSPamy的構(gòu)建
[0029] [1]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-MSPamy，導(dǎo)入E.coliJM109。將[2]中PCR回收的產(chǎn) 物與克隆載體PMD18-T連接，連接體系為solutionI5μL，目的基因4. 8μL，pMD18-T質(zhì) 粒0. 2μL，16°C過夜連接。連接接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109,涂布于含100ug/mL氨芐青霉素 的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含100ug/mL氨芐青霉素的10mL液體LB培養(yǎng) 基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-MSPamy，經(jīng)PCR和酶切驗證連接成功 后，將菌液加入甘油于-70 °C冰箱保藏。
[0030] [2]將[1]中提取的pMD18-T-MSPamy質(zhì)粒與表達(dá)載體pXMJ19分別進(jìn)行Hindlll 與BamHI的雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pXMJ19-MSPamy。 上述重組質(zhì)粒都通過PCR和酶切驗證。
[0031] 實施例4:重組質(zhì)粒pXMJ19-MSPamy電轉(zhuǎn)化至鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO.0890
[0032] 挑取鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890接種