一種改造尿素代謝調(diào)控途徑降低釀酒酵母尿素積累的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種改造尿素代謝調(diào)控途徑降低釀酒酵母尿素積累的方法，屬于微生 物遺傳和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯被認為是一種對人有潛在致癌性的物質(zhì)，并在1974年被國際癌癥 研究機構(gòu)（IARC)劃為2B級的致癌化合物。此后，研究人員又發(fā)現(xiàn)氨基甲酸乙酯也可以直 接誘發(fā)人的肝癌，進一步促使IARC在2007年將氨基甲酸乙酯的致癌等級由2B級提升到了 2A級（與甲醛同級）。而黃酒中的氨基甲酸乙酯，已經(jīng)成為危害消費者健康和影響其市場 競爭力的重要隱患。
[0003] 在清酒和黃酒中，由釀酒酵母代謝產(chǎn)生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前體物 質(zhì)。在發(fā)酵過程中，酵母細胞內(nèi)的尿素主要由精氨酸代謝產(chǎn)生。釀酒酵母尿素代謝的強弱 與兩個特異性的激活因子Dal81p和Dal82p的活性密切相關(guān)。
[0004] DalSlp和Dal82p是釀酒酵母中尿素代謝的兩個重要的激活因子，在尿素代謝基 因（DUR1，2和DUR3)的啟動子上都有它們的結(jié)合區(qū)。缺少Dal81p和Dal82p的激活作用， DUR1，2和DUR3的表達量將顯著的下降。為了增強菌株的尿素代謝能力，可以采取Dal81p 和Dal82p過量表達的策略。
[0005] 泛素化調(diào)控是釀酒酵母控制胞內(nèi)非偏好型氮源代謝的一種方式。在偏好型氮源環(huán) 境中，非偏好型氮源的透性酶或激活因子可被泛素標記，并被轉(zhuǎn)運至液泡內(nèi)降解。因此，可 以通過對透性酶或激活因子上的泛素化位點進行定點突變，延長這些蛋白在胞內(nèi)的存留時 間，提高非偏好型氮源的代謝速率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過改造尿素代謝途徑相關(guān)激活因子，降低了釀酒酵母發(fā)酵過程中尿素積 累，通過這種遺傳改造，可以從根本上減少釀酒酵母發(fā)酵過程中尿素的積累。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種降低酵母尿素積累的方法，所述方法是對尿素代 謝途徑調(diào)控因子Dal81p和Dal82p進行改造。
[0008] 所述改造是同時過量表達調(diào)控因子Dal82p和消除了泛素化調(diào)控位點的DalSlp。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Dal81p的泛素化調(diào)控位點指的是其第69和918 位賴氨酸（K)。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述消除了泛素化調(diào)控位點的DalSlp是指將氨基 酸序列為SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Dal82p的氨基酸序列是SEQIDN0. 2所示的序 列。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過量表達，指的是將Dal81p__^PDal82p先 后連接到表達載體PY26-GPD-TEF上，構(gòu)建表達載體pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并轉(zhuǎn)化到 酵母中表達。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達載體pY26-GPD-TEF的核苷酸序列是SEQID NO. 11所示的序列。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體是：將氨基酸序列為SEQID NO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸得到Dal81p K69A, K918A?再將 Dal82pDal81pK69A,_#氨基酸序列為SEQIDN0. 2的Dal82p先后連接到表達載體PY26-GPD-TEF上，構(gòu)建得到重組載體pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并將重組載體轉(zhuǎn)化到宿 主酵母中表達。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主酵母是釀酒酵母。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主酵母是釀酒酵母CEN.PK2_lC(MATa; ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ;his3A1 ;MAL2-8c;SUC2)單倍體模式菌株。
[0017] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種尿素積累能力降低的酵母，所述酵母過表達調(diào)控 因子Dal82p和消除了泛素化位點的Dal81p。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酵母的構(gòu)建方法是：（1)將氨基酸序列為SEQ 10勵.1的0&181?的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸得到0 &181?K69A，K918A;(2) 將Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列為SEQIDNO. 2的Dal82p先后連接到表達載體 PY26-GPD-TEF上，構(gòu)建得到重組載體pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p; (3)將重組載體轉(zhuǎn)化到 宿主酵母中表達。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主酵母是釀酒酵母，可以是釀酒酵母CEN. PK2-lC〇
[0020] 本發(fā)明還要求保護所述酵母在食品方面的應(yīng)用。
[0021] 所述的尿素積累減少，指的是基因工程菌株相對于野生菌株，在偏好型氮源阻遏 培養(yǎng)基中尿素的積累情況。偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基指的是在YNB培養(yǎng)基中添加了釀酒酵母 偏好型氮源。
[0022] 本發(fā)明的有益之處：本發(fā)明對釀酒酵母尿素代謝途徑相關(guān)激活因子進行了遺傳改 造，通過對2個激活因子的改造，尿素積累量分別減少了 55. 7%。通過對釀酒酵母的這種遺 傳改造，可以從根本上較少釀酒酵母發(fā)酵過程中尿素的積累。
【附圖說明】
[0023] 圖1 :代謝改造Dal81p和Dal82p對菌株尿素利用情況的影響。
【具體實施方式】
[0024] 尿素的檢測方法參考文獻KnorstMT,NeubertR,WohlrabW.Analyticalmethods formeasuringureainpharmaceuticalformulations.JournalofPharmaceuticaland BiomedicalAnalysis15, 1627-1632 (1997)。
[0025] 材料與方法
[0026] 本發(fā)明所用釀酒酵母菌株為CEN.PK2-lC(MATa;ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ; his3Al;MAL2-8%SUC2)單倍體模式菌株，其他操作均為常規(guī)分子生物學(xué)操作。
[0027] 大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，釀酒酵母的活化使用YH)培養(yǎng)基，釀酒酵母尿素 利用情況使用使用偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的配方如下。
[0028] LB培養(yǎng)基：10g·L1蛋白胨，5g·L1酵母浸膏，10g·LWaCl，ρΗ7· 4。篩選 E.coliJM109轉(zhuǎn)化子時，培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素100μg·mLS
[0029] YPD培養(yǎng)基：20g·L1蛋白胨，lOg·L1酉孝母浸膏，20g·L1葡萄糖；
[0030] 酵母轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)基：1. 7g·LiNB合成培養(yǎng)基（無氨基酸和硫酸銨），20g·L1 葡萄糖，lOmmol·L1硫酸銨，40mg·L1組氨酸，40mg·L1色氨酸，40mg·L1亮氨酸；
[0031] 偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基：1. 7g*LWNB合成培養(yǎng)基（無氨基酸和硫酸銨），20g*L1 葡萄糖，lOmmol·L1谷氨酰胺，lOmmol·L1 (尿素或其他單一的非偏好型氮源）。培養(yǎng)不同 的營養(yǎng)缺陷型基因工程菌株時，需補加菌株生長所必需的氨基酸或尿嘧啶（40mg·L3。 [0032] 實施例1
[0033] Dal81p泛素化位點的消除：使用MutanBESTkit定點突變試劑盒將氨基酸序列為 SEQIDNO. 1的Dal81p序列上的第69位和第918位的賴氨酸（K)位點突變?yōu)楸彼幔ˋ)， 所用引用見表1。
[0034] 表1Dal81p上泛素化位點定點突變引物
[0035]
[0036] 將突變產(chǎn)物連接至克隆載體pMD-19TSimple，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。挑取陽性轉(zhuǎn) 化子，經(jīng)Sanger測序驗證正確的用于下一步的過量表達。
[0037] Dal8lpK69A,K91SA^PIDal82p表達載體的構(gòu)建：設(shè)計引物擴增得至丨」DALS1 K69A, K918A和氨基 酸序列如SEQIDNO. 2的DAL82基因（正向引物添加SmaI或NotI限制性內(nèi)切酶酶切位 點；反向引物添加HindIII或BglII限制性內(nèi)切酶酶切位點）（見表2)。通過酶切-連 接的方式，將DAL81__a和DAL82分別先后亞克隆至表達載體pY26-GPD-TEF上，構(gòu)建重 組載體pY26-Dal8lpK69A,K91SA-Dal82p〇
[0038] 表 2 擴增DAL81K69A,_JPDAL82 基因的引物
[0039]
[0040] 將重組載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母CEN.PK2-1C，在酵母轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)基上挑取陽性轉(zhuǎn)化 子，用于尿素利用情況的進一步研究。
[0041] 將基因工程菌株和對照菌株（未經(jīng)改造的菌株），經(jīng)30°C搖床（200r/min)培養(yǎng) 24h活化后，接種至偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基中，在30°C搖床（200r/min)的條件下培養(yǎng)48h， 其間每隔8h檢測培養(yǎng)基中尿素的利用情況。
[0042] 對釀酒酵母基因工程菌株CEN.PK2-lC(pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p)和對照菌株 在真實的發(fā)酵條件下，尿素利用情況進行檢測。在添加了尿素的偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基中， 檢測了 48h發(fā)酵過程中尿素含量的變化情況，實驗結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，48h后檢測 的尿素含量比對照菌株分別下降了 55. 7%。
[0043] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種降低酵母尿素積累的方法，其特征在于，所述方法是對尿素代謝途徑調(diào)控因子 Dal81p和Dal82p進行改造。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是同時過量表達調(diào)控因子 Dal82p和消除了泛素化調(diào)控位點的DalSlp。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述消除了泛素化調(diào)控位點的DalSlp是 指將氨基酸序列為SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Dal82p的氨基酸序列是SEQIDNO. 2 所示的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：將氨基酸序列為 SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸得到Dal81p_A,K9m，再 將Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列為SEQIDNO. 2的Dal82p先后連接到表達載體 PY26-GPD-TEF上，構(gòu)建得到重組載體pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并將重組載體轉(zhuǎn)化到酵 母中表達。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述酵母是釀酒酵母。7. -種尿素積累能力降低的酵母，其特征在于，所述酵母過表達調(diào)控因子Dal82p和消 除了泛素化位點的Dal81p。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的酵母，其特征在于，所述酵母的構(gòu)建方法是：（1)將氨基酸序 列為SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突變成丙氨酸得到Dal81p_A,K91SA; (2)將Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列為SEQIDNO. 2的Dal82p先后連接到表達載體PY26-GPD-TEF上，構(gòu)建得到重組載體pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p; (3)將重組載體轉(zhuǎn)化到 酵母中表達。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的酵母，其特征在于，所述酵母是釀酒酵母。10. 權(quán)利要求7所述酵母在食品方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改造尿素代謝調(diào)控途徑降低釀酒酵母尿素積累的方法，屬于微生物遺傳和分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法是對尿素代謝途徑相關(guān)激活因子的改造，具體是在消除Dal81p的泛素化調(diào)控位點的基礎(chǔ)上，對Dal81pK69A,K918A和Dal82p進行過量表達。按照本發(fā)明方法對釀酒酵母尿素代謝途徑相關(guān)激活因子進行遺傳改造后，可以從根本上較少釀酒酵母發(fā)酵過程中尿素的積累，尿素積累量減少了55.7％。
【IPC分類】C12N1/19, C12N15/81, C12R1/865
【公開號】CN105274133
【申請?zhí)枴緾N201510816366
【發(fā)明人】周景文, 陳堅, 堵國成, 呂永坤, 趙鑫銳
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月20日