一種用于原始生殖細胞靶向突變的轉(zhuǎn)基因載體及制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于魚類生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于原始生殖細胞靶向突變的 轉(zhuǎn)基因載體及制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因編輯技術(shù)是揭示基因功能的重要研究工具（Esvelt，K.M.andWang,H. Η. (2013).Genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology.MolSyst Biol9, 641.)。近年來，相繼出現(xiàn)的基于核酸內(nèi)切酶的基因組編輯技術(shù)，如：鋅指核糖核酸 1? (Zinc-fingernucleases,ZFNs)(Bibikova,M. ,Beumer,K. ,Trautman,J.K.andCarroll ,D. (2003).Enhancinggenetargetingwithdesignedzincfingernucleases.Science 300, 764·)，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcriptionactivatorlikeeffector nucleases,TALENs) (Bedell,V.M. ,Wang,Y. ,Campbell,J.M. ,Poshusta,T.L. ,Starker,C. G. ,Krug,R.G. , 2nd,Tan,ff. ,Penheiter,S.G. ,Ma,A.C. ,Leung,A.Y.etal. (2012).In vivogenomeeditingusingahigh-efficiencyTALENsystem.Nature491, 114-8.) 和ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR) / CRISPR-associated(Cas) 9 系統(tǒng)（Liu,D.，Wang,Z.，Xiao,A.，Zhang,Y.，Li,W.，Zu,Y.，Yao, S. ,Lin,S.andZhang,B. (2014).Efficientgenetargetinginzebrafishmediatedbya zebrafish-codon-optimizedcas9andevaluationofoff-targetingeffect.JGenet Genomics41，43-6.)，徹底革新了可遺傳的定點基因功能缺失研究。與ZFNs和TALENs相 比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)效率高，而且更容易操作，已成為構(gòu)建基因敲除動物模型的主要技術(shù)。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)是利用能夠特異識別DNA序列的RNA(guideRNA，gRNA)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶 Cas9在基因組的特定位點引入DNA雙鏈斷裂，然后細胞的非同源末端修復(fù)機制在靶點序列 產(chǎn)生隨機增減或移碼突變，從而達到特異改變靶點遺傳信息的目的。
[0003] 在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備突變斑馬魚的研究中，研究者們普遍使用體外轉(zhuǎn)錄 的方法合成核酸內(nèi)切酶Cas9mRNA，然后將Cas9mRNA注射到斑馬魚胚胎中產(chǎn)生Cas9蛋白。 然而目前體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)對實驗員的操作技能要求較高，否則會面臨合成不出來，或者合成 的濃度太低，或者合成的Cas9mRNA存在降解等問題。并且，體外轉(zhuǎn)錄出的Cas9mRNA在長 期保存過程中，以及每次使用時反復(fù)凍存，都會影響保存的Cas9mRNA的質(zhì)量。除了耗時耗 力，體外轉(zhuǎn)錄的試劑盒往往比較昂貴。如果建立表達Cas9的斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系，就能直接 以該品系胚胎為受體，利用胚胎自身表達的Cas9產(chǎn)生切割作用。然而在魚類中缺乏穩(wěn)定表 達Cas9的品系。
[0004] 另外，在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因敲除時，注射靶基因的gRNA和Cas9mRNA 后，體細胞的高效突變可以在P0代胚胎中就能進行表型分析（Liu，D.，Wang，Z.，Xiao,A.， Zhang,Y. ,Li,ff. ,Zu,Y. ,Yao,S. ,Lin,S.andZhang,B. (2014).Efficientgenetargeting inzebrafishmediatedbyazebrafish-codon-optimizedcas9andevaluationof off-targetingeffect.JGenetGenomics41，43-6·)。然而，如果革巴基因是胚胎早期發(fā)育 必需基因，體細胞的高效突變也將導(dǎo)致胚胎死亡。例如當(dāng)我們嘗試在斑馬魚中制備tcf711a 基因的突變體時，用較高濃度的tcfTlla-gRNA和Cas9mRNA注射到胚胎后，85%的胚胎產(chǎn) 生嚴重畸形不能存活下去，而存活的胚胎往往不攜帶需要的移碼突變。如果降低注射劑量 以減少突變，雖能減少體細胞的突變使胚胎存活，但也會導(dǎo)致生殖細胞的突變降低，增加后 續(xù)篩選的難度。因此，對于研制胚胎發(fā)育早期的必需基因突變品系，有必要減少體細胞突變 以提高胚胎存活率，同時增加生殖細胞突變率以增加突變向后代傳遞的效率。
[0005] 成體的生殖細胞都是由胚胎發(fā)育早期形成的原始生殖細胞（primordialgerm cells,PGC)發(fā)育而來（Braat，Α·Κ·，Speksnijder，J.E.andZivkovic，D. (1999) ·Germline developmentinfishes.IntJDevBiol43, 745-60.)。因此，PGC是胚胎發(fā)育階段唯一 能將遺傳信息遞給子代的細胞類群。作為遺傳物質(zhì)的傳遞者，魚類PGC細胞因在早期就能 被標(biāo)記、除去、分離、具有全能性等特點，已成為了魚類生物工程技術(shù)的良好遺傳操作對象 (Yoshizaki,G. ,Takeuchi,Y.andOkutsu,Τ· (2007) ·〃Germcellinfish:basicbiology andbiotechnologicalapplications".TanpakushitsuKakusanKoso52,2067-72.)〇 如 果在胚胎時期特異性提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在PGC中的突變率，就能減少體細胞突變，從而 應(yīng)用于胚胎早期發(fā)育必需基因突變體的制備。另外，增加親代PGC的突變率，即生殖細胞突 變率，就能增加子代中突變比例，從而降低制備突變品系過程中篩選突變子代的工作量。
[0006] 在我們之前的研究中，利用轉(zhuǎn)錄水平的Gal4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，以mRFP作為報 告基因，實現(xiàn)斑馬魚PGC中高效、特異、持續(xù)的基因誘導(dǎo)表達調(diào)控技術(shù)（Xiong，F(xiàn).，Wei，Z. Q.,Zhu,Z.Y.andSun,Y.H. (2013).Targetedexpressioninzebrafishprimordialgerm cellsbyCre/loxPandGal4/UASsystems.MarBiotechnol(NY) 15, 526-39·)。為了特異 性提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生殖細胞中的突變率，本發(fā)明在我們之前建立的PGC特異表達 KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(kop:KalTA4)基礎(chǔ)上，以Cas9蛋白作為效應(yīng) 品系的報告基因，在斑馬魚中建立原始生殖細胞中高效、特異、持續(xù)誘導(dǎo)Cas9表達的轉(zhuǎn)基 因品系。首先，構(gòu)建UAS和nanos3 3'UTR調(diào)控Cas9表達的轉(zhuǎn)基因載體pTol2(UAS:Cas9);其 次，建立效應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系Tg(UAS:Cas9)。在效應(yīng)品系中，Cas9是沉默的。當(dāng)Tg(kop:KalTA4) 品系雌魚與Tg(UAS:Cas9)品系雄魚雜交后，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能誘導(dǎo)Cas9在雜交 胚胎原始生殖細胞中高效、特異、持續(xù)地表達，從而在斑馬魚中建立原始生殖細胞特異表達 Cas9的轉(zhuǎn)基因品系。最后，我們利用該品系的胚胎可以制備出早期發(fā)育必需基因的突變品 系。同時，該品系的建立也能節(jié)約體外合成Cas9mRNA的花費和工作量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了 一種用于原始生殖細胞靶向突變的轉(zhuǎn)基因載體： pTol2(UAS:Cas9)，其序列為SEQIDNO. 1所示。該轉(zhuǎn)基因載體包含受UAS和nanos3 3'UTR 調(diào)控Cas9的表達框序列，并在Cas9起始密碼子前引入了Kozak序列，用于增強轉(zhuǎn)基因的表 達；該表達框位于T〇12轉(zhuǎn)座子的左右臂序列中，以便可以使用T〇12轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因 魚，提高轉(zhuǎn)基因的整合效率。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種受UAS和nanos3 3'UTR調(diào)控Cas9表達 的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(UAS:Cas9)的制備方法。通過將轉(zhuǎn)基因載體pT〇12(UAS:Cas9)與 T〇12轉(zhuǎn)座酶mRNA導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，轉(zhuǎn)基因魚性成熟后，與野生型的雌魚雜交，篩選出 轉(zhuǎn)基因陽性的子代，即建立Tg(UAS:Cas9)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。
[0009] 本發(fā)明的最后一個目的是在于提供了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(UAS:Cas9)或 pT〇12(UAS:Cas9)在制備魚突變品系中的應(yīng)用。首先將目的基因有效的gRNA注射到Tg(kop:KalTA4) (Xiong,F. ,Wei,Z.Q. ,Zhu,Z.Y.andSun,Y.H. (2013).Targetedexpressi oninzebrafishprimordialgermcellsbyCre/loxPandGal4/UASsystems.Mar Biotechnol(NY) 15, 526-39.)雌魚與Tg(UAS:Cas9)雄魚雜交胚胎中建立P0代，然后通過逐 代的篩選，獲得能穩(wěn)定遺傳的目的基因的突變品系。
[0010] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施：
[0011] 一種用于原始生殖細胞靶向突變的轉(zhuǎn)基因載體：pT〇12(UAS:Cas9)，其序列為SEQ IDNO. 1 所示。
[0012] 轉(zhuǎn)基因載體PTol2(UAS:Cas9)構(gòu)建方法，包括下述步驟：
[0013] 1)重組基因片段的獲得：
[0014] 以UAS_F和UAS_R引物對UAS序列進行擴增獲得UAS;以Cas9_F和Cas9_R引物對 Cas9編碼區(qū)進行擴增獲得Cas9編碼區(qū)；以nos_F和nos_R引物對nanos3 3'UTR序列進行 擴增獲得nanos3 3'UTR;以UAS，Cas9編碼區(qū)和nanos3 3'UTR，這3個DNA片段共同為模 板，以UAS_F和nos_R為引物，PCR擴增出由UAS，Cas9編碼區(qū)和nanos3 3'UTR這3段DNA 分子片段拼接成的重組基因片段，即UAS:Cas9-UTRn〇s3表達框序列。
[0021] 2)在商業(yè)載體pMD18_T(TaKaRa公司）質(zhì)粒基礎(chǔ)上，人工合成包含Tol2轉(zhuǎn)座子序 列左臂和右臂的載體pT〇12-MCS，其序列為SEQIDΝ0. 2所示。
[0022] 3)將獲得的重組基因片段及載體pT〇12-MCS連接成轉(zhuǎn)基因載體 pTol2(UAS:Cas9)。
[0023] 將UAS:Cas9-UTRnos3表達框序列及人工合成的載體pTol2-MCS(SEQIDN0. 2所 示）用Mlul和Xhol雙酶切連接后即得轉(zhuǎn)基因載體PTol2(UAS:Cas9)，其序列為SEQID NO: 1所示。