[0031] 1. 3. 10. 2樣品定值方法不確定度評(píng)估 按隨機(jī)表取樣品15份，每份樣品平行測(cè)量2次，用結(jié)果的對(duì)數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證。
[0032] 1. 3. 10. 3電子天平及移液器的不確定度評(píng)估 參照文獻(xiàn)及校準(zhǔn)所依據(jù)的JJG646-2006《移液器檢定規(guī)程》、JJG1036-2008《電子天 平檢定規(guī)程》對(duì)電子天平及移液器精選校準(zhǔn)。
[0033] 1. 3. 11凍干樣品穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 分別將樣品存儲(chǔ)在-20°C、4°C、25°C環(huán)境中，于存儲(chǔ)0、1、6、9、12個(gè)月時(shí)分別取出6瓶進(jìn) 行分析。
[0034] 結(jié)果與分析 2.1菌液0D_值及對(duì)應(yīng)的菌數(shù)范圍 表6 0D_值對(duì)應(yīng)的菌數(shù)
對(duì)新鮮菌液進(jìn)行〇D_值檢測(cè)，根據(jù)表6評(píng)估菌液的含菌數(shù)以方便實(shí)驗(yàn)安排。
[0035] 2. 2保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果 表7正交試驗(yàn)結(jié)果
由表7結(jié)果可知，7號(hào)保護(hù)劑配方的保護(hù)率最高，忍為32. 39%，標(biāo)準(zhǔn)差為0. 074%，選擇 該保護(hù)劑配方作為凍干保護(hù)劑。
[0036] 2.3混懸液的保護(hù)率 表8混懸液的保護(hù)率
由表8結(jié)果可知，9號(hào)配制結(jié)果：戽為36. 67%，標(biāo)準(zhǔn)差為0. 048%，選用9號(hào)方案配制混 懸液。
[0037] 2.4混懸液菌數(shù)短期下降率 根據(jù)戽為36. 67%和新鮮菌液含菌數(shù)（4. 0X10 8CFU/mL~5. 0X10sCFU/mL)設(shè)計(jì)混懸 液菌數(shù)水平見(jiàn)表9。
[0038] 表9混懸液菌數(shù)設(shè)計(jì)
根據(jù)表9配制混懸液后，按2mL/瓶分裝，按照表5冷凍干燥參數(shù)進(jìn)行凍干，凍干樣品含 菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表10。
[0039] 表10混懸液菌數(shù)測(cè)定（CFU/瓶）
根據(jù)公式2計(jì)算菌數(shù)下降率疋，結(jié)果見(jiàn)表11。
[0040] 表11菌數(shù)下降率（％)
由表11結(jié)果可知高、中、低菌數(shù)的樣品凍干后菌數(shù)從第14天到第40天相對(duì)穩(wěn)定，計(jì)算X4D的平均值為67. 66%。將值帶入公式（3)、（4)，計(jì)算得混懸液的菌數(shù)應(yīng)在8. 4X10 2CFU/ mL~2· 5X103CFU/m內(nèi)。
[0041] 2.5志賀氏菌驗(yàn)證 VITEK2生化鑒定結(jié)果是97%為供1so/Mei，結(jié)果判定為Excellent identifiation。
[0042] 2.6均勻性驗(yàn)證 將樣品于制備完成的第40天在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)，6個(gè)批次記為6，每批 次抽取15個(gè)樣品，記為：ηι~η15，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表12。
[0043] 表12樣品的含菌數(shù)（CFU/瓶）
由表12結(jié)果可知：

該統(tǒng)計(jì)量是自由度的F分布變量。根據(jù)自由度及給定的顯著性水平α =〇. 05,查 得Α2. 19〈尸。=2. 201，則組內(nèi)和組間無(wú)顯著性差異，即樣品均勻。
[0044] 2. 7凍干樣品的定值 2. 7. 1凍干樣品的標(biāo)準(zhǔn)值 樣品的標(biāo)準(zhǔn)值采用均勻性實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù)結(jié)果，即標(biāo)準(zhǔn)值=530 CFU/瓶。
[0045] 2. 7. 2樣品的不確定度評(píng)估 2. 7. 2. 1菌落計(jì)數(shù)方法不確定度的評(píng)估結(jié)果 表13計(jì)數(shù)方法不確定度的檢測(cè)結(jié)果
注·；馬.，Α為每傍·童復(fù)定的兩十結(jié)栗、 根據(jù)貝塞爾計(jì)算公式，計(jì)算出檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差合并樣本的標(biāo)準(zhǔn)差5；，以評(píng)估 計(jì)數(shù)方法帶來(lái)的不確定度。
[0046] 根據(jù)公式
計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果的殘差值，并進(jìn)一步計(jì)算樣 品檢測(cè)結(jié)果的殘差平方及殘差平方和計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表14。
[0047] 表14檢測(cè)結(jié)果的殘差平方及殘差平方和
根據(jù)貝塞爾計(jì)算公式，可計(jì)算出檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差合并樣本的標(biāo)準(zhǔn)差：
其中，?為檢測(cè)的樣本數(shù)，即為每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)的次數(shù)，S卩/7=2; 總體合成的樣本差：
，則擴(kuò)展不確定度：G=tX心取置信水平95%， 自由度）=1〇,經(jīng)過(guò)查?分布表得：?〇.。5<；1。)=2.228 ; 得出G=2. 228X0. 0093=0. 021。
[0048] 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以2次測(cè)量對(duì)數(shù)值的平均值表示時(shí)，其值區(qū)間分布于±0. 021之間。由 于菌數(shù)最小基數(shù)為1，因此該不確定度可忽略不計(jì)。
[0049] 2. 7. 2. 2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的不確定度評(píng)估結(jié)果 取不同批次的凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10份(于_70°C存儲(chǔ)40天)，每份樣品平行測(cè)量2次，計(jì)數(shù) 結(jié)果見(jiàn)表15。
[0050] 表15定值方法不確定度的計(jì)數(shù)結(jié)果
其中，?為檢測(cè)的樣本數(shù)，即^f1〇;/7為每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)的次數(shù)，即/7=2,則標(biāo)準(zhǔn)偏差 合并樣本樣品標(biāo)準(zhǔn)差：5；=15. 16575089CFU/瓶，則總體合成的樣本
CFU/瓶。取置信水平95%，/(自由度）=10,經(jīng)過(guò)查汾布表得：?〇.。_ =2. 228,擴(kuò)展不確定 度：％=tXG=2. 228X10. 72380529=23. 8926382,取整數(shù)則壚24CFU/ 瓶。
[0051] 當(dāng)測(cè)量檢驗(yàn)結(jié)果用2次測(cè)量值平均值表示結(jié)果時(shí)，其值分布區(qū)間至±24CFU/瓶 之間。這個(gè)取值的區(qū)間適用于每一次測(cè)量。
[0052] 2. 7. 2. 3移液器和電子天平的不確定度 移液器本次校準(zhǔn)容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：爐0.l%(k=2);電子天平擴(kuò)展 不確定度爐2. 7934mg。故本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值中移液器和電子天平的不確定度可忽略不計(jì)。
[0053] 2.8樣品的穩(wěn)定性 樣品存儲(chǔ)在_20°C、4°C、25°C，每個(gè)時(shí)間取6瓶檢測(cè)，以平均值作為檢測(cè)數(shù)值，結(jié)果見(jiàn)表 16。
[0054] 表16凍干樣品的穩(wěn)定性測(cè)量數(shù)據(jù)
表16中數(shù)據(jù)顯示，保存第1個(gè)月，由于冷凍干燥后，樣品性狀不穩(wěn)定，細(xì)菌對(duì)環(huán)境溫度 的變化敏感，樣品含菌數(shù)下降幅度大，因此除去第〇個(gè)月數(shù)值，以X代表時(shí)間，y代表凍干樣 品的特性值(菌含量)，擬合成一條直線，-20°C、4°C、25°C斜率分別記為A、4、4。以_2〇°C 為例，計(jì)算如下：
自由度為η-2,ρ=0· 95 (95%置信水平），則?=4· 30。
[0055]
故斜率是不顯著的，因而樣品在-20°C保存第1個(gè)月起至第12個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。
[0056] 4°C及25°C的穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表17。
[0057] 表17凍干樣品的穩(wěn)定性
由表17結(jié)果顯示，樣品在4°C保存第1個(gè)月起至第12個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。在25°C保存第1個(gè)月起至第9個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。
[0058] 結(jié)論 3. 1凍干配方保護(hù)劑的配制方案 通過(guò)正交試驗(yàn)獲得配方保護(hù)劑的最佳配制方案：設(shè)定純水體積為&，蔗糖體積 為隊(duì)=&，脫脂奶體積為N3=4N2，聚乙烯吡咯烷酮和酪氨酸的體積分別為2% (N2+N3)和 4%(N2+N3)，其凍干保護(hù)率為32. 39%。
[0059] 3.2混懸液的配制方案 以凍干后保護(hù)率為指標(biāo)獲得混懸液的最佳配制方案：雞肉基質(zhì)與無(wú)菌水按lg/7mL的 比例配制后再與保護(hù)劑按體積比1:3混勻，加入體積濃度為1%的新鮮菌液，使所得混懸液 中含菌數(shù)在8. 4X102~2. 5X103CFU/mL，其保護(hù)率為36. 67% ;-20°C保存40天時(shí)菌數(shù)下降率 為 67. 66%。
[0060] 3. 3穩(wěn)定性跟蹤 追蹤樣品保存于_20°C、4°C以及25°C下12個(gè)月的特性值穩(wěn)定性，其-20°C和4°C保存 下12個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性，25°C保存9個(gè)月穩(wěn)定性良好。60°C運(yùn)輸溫度下短期穩(wěn)定性較 差。
[0061] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于：其制備方法包括以下步驟： 1) 保存液的配制：將志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉用志賀氏菌增菌肉湯溶解后，劃線接種 于志賀氏菌顯色培養(yǎng)基上，36± 1°C下培養(yǎng)20h-48h;然后挑取單菌落接種于志賀氏菌增菌 肉湯中，41. 5土1°C下培養(yǎng)16h-20h;吸取菌液于無(wú)菌離心管中，加入其體積1. 5倍、質(zhì)量濃 度為40%的無(wú)菌甘油，混合，制成保存液； 2) 基質(zhì)預(yù)處理：將雞肉剔除脂肪組織后，冷凍干燥至脫水率為75%，然后將脫水雞肉粉 碎至組織細(xì)度為170目，采用6°C〇y輻射滅菌后分裝備用； 3) 混懸液的配制：按lg雞肉基質(zhì)加入7mL無(wú)菌水的比例，將預(yù)處理后的雞肉基質(zhì)與水 混合成基質(zhì)懸液，再加入其3倍體積的保護(hù)劑，混合制得混懸液； 4) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備：取步驟1)制備的保存液2yL于200mL志賀氏菌增菌肉湯中， 41. 5± 1 °C下進(jìn)行培養(yǎng)，并利用多功能酶標(biāo)儀定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液的OD_ηηι值，當(dāng)OD_ηηι 為0. 270 ±0. 1時(shí)停止培養(yǎng)，得新鮮菌液，然后將新鮮菌液按混懸液體積濃度1%加入到步驟 3)制得的混懸液中，于恒溫振蕩器上300r/min搖勾30min，再按2mL/瓶進(jìn)行分裝，其含菌 量為8. 4X102~2. 5X103CFU/mL，最后經(jīng)冷凍干燥，制得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)； 5) 檢驗(yàn)：將所得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行菌種鑒定、均勻性驗(yàn)證、定值、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，制得成品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于：步驟1)所得保 存液的平均菌數(shù)為4. 3X107CFU/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于：步驟2)所用雞 肉需先經(jīng)檢測(cè)不含抗生素；所用6°Coγ的輻射劑量為6KGY。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于：步驟3)所述保 護(hù)劑是將脫脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸與水按體積比4:0. 1:1:0. 2:1混合而成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于：步驟4)經(jīng)冷凍 干燥后所得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含菌量為530±24CFU/瓶。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其具體經(jīng)保存液的配制、基質(zhì)預(yù)處理、混懸液的配制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備及菌種鑒定、均勻性驗(yàn)證、定值、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，制得含菌數(shù)為530±24？CFU/瓶的成品。所得含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性，可解決現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中雞肉基質(zhì)難溶于水的問(wèn)題，且其品質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控，適用于微生物高效、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。
【IPC分類】C12Q1/06, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN105274187
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510805378
【發(fā)明人】林杰, 柯璐, 鄭晶, 黃曉蓉, 陳彬, 徐珊, 戴曉麗
【申請(qǐng)人】福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月20日