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一種快速高通量檢測細菌文庫質粒大小的方法

文檔序號:9519346閱讀:1098來源:國知局
一種快速高通量檢測細菌文庫質粒大小的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物與新醫(yī)藥技術領域,具體涉及一種快速高通量檢測細菌文庫質粒大小的方法。
【背景技術】
[0002]隨著測序技術的不斷發(fā)展,越來越多的微生物基因組獲得了完整的序列信息。而在這些研究領域,文庫的構建成為其不可缺少的手段,尤其是實驗室內部,通過構建各種不同大小的文庫,進行功能片段的研究及測序,愈發(fā)顯得重要。文庫的群體大,往往需要覆蓋物種基因組的2-3倍以上,可達上萬個克隆,從文庫中篩選不同大小的目標克隆,工作量巨大,難度也高。
[0003]常規(guī)的細菌如大腸桿菌重組質粒篩選方法有6種:(1)A互補。(2)插入失活。(3)菌落原位雜交。(4)限制性內切酶酶切反應。(5)菌落/菌液PCR法。(6)質粒抽提。前兩種方法盡管操作簡單但使用范圍較窄,第三和第四種方法操作繁瑣,且耗費資金。第五種方法易出現假陽性。第六種方法,耗時較長,且不能實現高通量。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對上述現狀,旨在提供一種快速高通量檢測細菌文庫質粒大小的方法。
[0005]為了達到上述目的,本發(fā)明技術方案通過對細菌重組菌的4步處理:1)溶液I進行菌體懸浮;2)溶液II進行菌體裂解;3)溶液III除蛋白;4)DNA凝膠電泳,進行革蘭氏陰性或陽性菌重組質粒大小的檢測。
[0006]一種快速高通量檢測細菌文庫質粒大小的方法,具體步驟下:
[0007]1)菌體懸浮。利用溶液I在離心管中進行菌體懸浮。
[0008]溶液I的配方對于革蘭氏陰性菌是25mM Tris-HCl,25mM EDTA,0.02% (m/v)溴酚蘭;對于革蘭氏陽性菌是 0.2% (m/v)溶菌酶,25mM Tris-HCl, 25mM EDTA,0.02% (m/v)溴酚蘭。
[0009]2)菌體裂解。在步驟1)的離心管中加入溶液II,溶液II的配方是0.3M NaOH,2% (m/v)SDS,混勻后置于70°C水浴鍋中水浴15分鐘。
[0010]3)除蛋白。在步驟2)的離心管中加入溶液III,混勻后,12000rpm離心10分鐘,溶液III的配方是苯酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)。
[0011 ] 4)進行DNA凝膠電泳。取步驟3)中的離心上清液直接點樣進行0.8 %的DNA瓊脂糖凝膠凝膠電泳即可判斷重組質粒插入片段的大小。
[0012]根據以上方案,優(yōu)選的,步驟1)中,在1.5ml離心管中加入12.5 μ 1-25 μ 1溶液I,并用滅菌中號移液器吸頭從富集培養(yǎng)的平板上挑取102-105CFU/cm2的1平方厘米的菌體到上述離心管中,振蕩器上振蕩5秒混勻后,丟掉吸頭。
[0013]優(yōu)選的,步驟2)中,在步驟1)的離心管中加入6.25μ 1-12.5μ1溶液II,輕輕顛倒混勻5秒。
[0014]優(yōu)選的,步驟3)中,在步驟2)的離心管中加入5 μ 1-10 μ 1溶液III,混勻5秒。
[0015]優(yōu)選的,步驟4)中,取步驟3)中的離心上清液10μ 1直接點樣進行0.8%的DNA凝膠電泳,不必加上樣緩沖液。
[0016]優(yōu)選的,步驟2)中,菌體是革蘭氏陽性菌時,先將步驟1)的離心管置于50°C水浴鍋中水浴30分鐘,再繼續(xù)加入12.5 μ 1溶液II。
[0017]與現有技術相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0018]1)本發(fā)明所述的快檢的方法不需要提出質粒出來,4步就可以看到質粒的大小,同時可以檢測到幾十個質粒,只要跑膠槽數量足夠,一次性可檢測幾時甚至上百個質粒。
[0019]2)本發(fā)明所述方法,步驟簡單,便于操作;所需試劑量少,節(jié)約成本;時間快速,2小時內出鑒定結果;檢測數量多,較短時間內一次性可以檢測幾十上百個樣品,可以實現高通量。
[0020]3)常規(guī)質粒抽提試劑中沒有加溴酚藍檢測試劑和溶菌酶,所以只能抽提革蘭氏陰性菌如大腸桿菌,而且所需要的試劑體積也很多(一般都是100-200微升以上),本發(fā)明方法是既可以檢測陰性菌也可以檢測陽性菌如芽胞桿菌,試劑用量少,才十幾微升即可達到效果,簡化了步驟,節(jié)約了試劑成本,達到高通量。
【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1中獲得的大腸桿菌質粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0022]泳道1-44 (泳道4和28除外):大腸桿菌文庫轉化子質粒
[0023]泳道4 和 28:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0024]圖2為實施例1中常規(guī)方法獲得的大腸桿菌質粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0025]泳道1:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0026]泳道2-5:大腸桿菌質粒
[0027]圖3為實施例2中獲得的蘇云金芽胞桿菌質粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0028]泳道1-44 (泳道1和26除外):蘇云金芽胞桿菌文庫轉化子質粒
[0029]泳道1 和 26:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0030]圖4為實施例2中常規(guī)方法獲得的蘇云金芽胞桿菌質粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0031]泳道1-6:蘇云金芽胞桿菌質粒
[0032]泳道7:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明實施例所用技術方案,如未特別說明,均為本領域使用的常規(guī)技術,所用試劑如未特別說明,均購自試劑耗材生物公司。
[0034]實施例1:
[0035]一種快速高通量檢測細菌革蘭氏陰性菌文庫質粒大小的方法,其步驟如下:
[0036]本實施例所檢測的革蘭氏陰性菌文庫為E.coli DH5 α為受體菌,蘇云金芽胞桿菌基因組基因文庫(劉曉艷,蘇云金芽胞桿菌菌株CT-43中蘇云金素合成基因簇thuAB⑶EFG的克隆與合成途徑分析,博士畢業(yè)論文,華中農業(yè)大學,2008)。
[0037]步驟A,菌體懸浮。在1.5ml離心管中加入12.5μ 1溶液I,并用滅菌中號移液器吸頭從富集培養(yǎng)的平板上挑取103-105CFU/cm2的1平方厘米的大腸桿菌到上述離心管中,振湯器上振湯混勾5秒鐘后,丟掉吸頭。
[0038]步驟B,菌體裂解。在步驟A的離心管中繼續(xù)加入6.25 μ 1溶液II,輕輕顛倒混勻5秒鐘后,置于70°C水浴鍋中水浴15分鐘。
[0039]步驟C,除蛋白。取出步驟B中的離心管,繼續(xù)加入5μ 1溶液III,振蕩器上振蕩混勻5秒鐘后,12000rpm離心機中離心10分鐘。
[0040]步驟D,進行DNA凝膠電泳。取步驟C中的離心上清液10 μ 1,直接點樣進行0.8%的DNA瓊脂糖凝膠電泳(不必加上樣緩沖液)。以空載體質粒作為對照,即可判斷重組質粒插入片段的大小。
[0041]溶液I 的配方為 25mM Tris-HCl, 25mM EDTA,0.02% (m/v)溴酚蘭,其余為水;
[0042]溶液II的配方為0.3M NaOH, 2% (m/v) SDS,其余為水;
[0043]溶液III為苯酚:氯仿:異戊醇按體積比25:24:1配制的混合物。
[0044]以上溶液配制時,所用的水為minipore純水儀中制備的超純水。
[0045]常規(guī)方案:
[0046]步驟A,接種大腸桿菌于5ml LB液體培養(yǎng)基中至對數生長中期。
[0047]步驟B,收集菌體,TE buffer洗滌一次。
[0048]步驟C,加100 μ 1溶液I,置冰上5’。
[0049]步驟D,加200 μ 1溶液11,快速顛轉混勻,置冰上3_5’。
[0050]步驟Ε,加150 μ 1溶液III,混勻,冰上靜置5-10’。
[0051]步驟F, 12000rpm/5’,取上清。
[0052]步驟G,苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),吸取下層液體,混勻后12000rpm,5分鐘離心,取上層液體。
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