用于牛肉中豬肉成分定量檢測(cè)的組合物、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于定量檢測(cè)牛肉中豬肉成分 的等溫?cái)?shù)字化padlock-RCA-microscopy方法，用于所述方法的寡核苷酸探針組合物，以及 包含所述組合物的padlock-RCA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉類摻假是重要的食品檢驗(yàn)項(xiàng)目。目前肉類摻假的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要采用 PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR技術(shù)。該技術(shù)的原理是根據(jù)動(dòng)物特異性的基因片段序列、設(shè)計(jì)引物和探 針，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生針對(duì)該特異性基因片段的信號(hào)，從而判斷樣品中是否含有該 動(dòng)物成分。這種方法在進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，需要制備不同含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過實(shí)時(shí)熒光PCR 定量曲線計(jì)算樣品中目標(biāo)成分的含量。由于肉品加工方式多樣，樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品之間的差 異會(huì)帶來巨大的誤差。
[0003]目前的數(shù)字化PCR技術(shù)通過將樣品DNA模板物理分隔，使每個(gè)微小的反應(yīng)體系僅 包含單個(gè)模板，通過統(tǒng)計(jì)大數(shù)量反應(yīng)體系的擴(kuò)增信號(hào)，推算樣品中目標(biāo)模板的比例。該技術(shù) 擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的依賴，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的直接數(shù)字化檢測(cè)。但該技術(shù)依賴于昂貴的數(shù)字化 PCR儀和試劑盒，而且每次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一個(gè)或少數(shù)樣品。
[0004] 利用滾環(huán)復(fù)制技術(shù)（RCA，rollingcircleamplification)檢測(cè)革E核酸序列一般 具有兩種途徑，一種直接擴(kuò)增環(huán)形單鏈模板，然后檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)；另一種途徑利用鎖式探針(padlockprobe)，鎖式探針的兩端與祀核酸序列特異性互補(bǔ)，通過連接反應(yīng)環(huán)化與模板鏈 雜交的探針，再擴(kuò)增已經(jīng)環(huán)化的探針，然后檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道能同時(shí)簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地檢測(cè)牛肉中豬肉含量的方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝藀adlock-RCA-microscopy等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法，該方法采用基于 padlock探針的RCA技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)豬和牛生長(zhǎng)激素基因的特異性padlock探針，在液相環(huán) 境中完成探針對(duì)生長(zhǎng)激素基因序列的識(shí)別和成環(huán)連接，通過固定在玻片上的捕獲探針捕獲 padlock環(huán)，利用帶熒光標(biāo)記的檢測(cè)探針進(jìn)行固相RCA滾環(huán)復(fù)制，最后在顯微鏡下通過檢測(cè) 探針的熒光標(biāo)記鑒定序列。
[0007] 本發(fā)明的方法在等溫條件下進(jìn)行，能夠?qū)崿F(xiàn)常規(guī)操作條件下的數(shù)字化檢測(cè)，同時(shí) 突破了實(shí)時(shí)熒光PCR方法受標(biāo)準(zhǔn)品限制，數(shù)字化PCR操作繁瑣，儀器昂貴，通量低等瓶頸。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了定量檢測(cè)牛肉中豬肉成分的特異性牛padlock寡核 苷酸探針SEQIDNo.l(5'AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGGATGTGTTCAG3'）和 特異性豬padlock寡核苷酸探針SEQIDNo. 2(5'AACCTTGGGCTTTGGGGCTGCTCATAGACTAGTGC CAGATGGATGGGGCACC3'）。在所述兩個(gè)序列的的5'端是磷酸基團(tuán)。該padlock探針分別識(shí) 別牛和豬生長(zhǎng)激素基因的DNA序列，并使其連接成環(huán)。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，還提供了捕獲探針序列SEQID No. 3(GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3'）。在捕獲探針5'端有連接分子，例如生物素。通過該捕 獲探針，使連接成環(huán)的DNA序列富集在固相上，例如固定在玻片上。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，還提供了牛檢測(cè)探針序列SEQID No.4(5'CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3'）和豬檢測(cè)探針序列SEQIDNo.5(5'CTAGTGCTGGATGATC GTCCUUUU-3'），在所述兩種檢測(cè)探針的5'端連接有不同的熒光素，例如在牛檢測(cè)探針的5' 端標(biāo)記FITC，在豬檢測(cè)探針的5'端標(biāo)記cy3。該檢測(cè)序列對(duì)固相上的成環(huán)DNA序列進(jìn)行 RCA滾環(huán)復(fù)制，用于在顯微鏡下進(jìn)行進(jìn)一步的觀測(cè)。
[0011] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的組合物。
[0012] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于定量檢測(cè)牛肉中豬肉成分的padlock-RCA試 劑盒，所述試劑盒中包含所述寡核苷酸序列或所述組合物。
[0013] 本發(fā)明提供的試劑盒包括本發(fā)明的用于padlock-RCA方法檢測(cè)牛肉中豬肉成分 的特異性padlock探針和使用說明書。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的牛肉和豬肉特異性 padlock探針分別根據(jù)牛和豬的生長(zhǎng)激素基因序列設(shè)計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒 中包含牛padlock探針序列為padlockcow:5'AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGG ATGTGTTCAG3'（SEQIDNo. 1)，豬padlock探針序列為padlockpig:5'AACCTTGGGCTTTGGGGC TGCTCATAGACTAGTGCCAGATGGATGGGGCACC3'（SEQIDNo. 2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒 中還包含捕獲探針序列：5'GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3'（SEQIDNo. 3)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述試劑盒中還包含牛檢測(cè)探針序列SEQIDNo. 4(5'CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3'）和豬 檢測(cè)探針序列SEQIDNo. 5(5'CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3'）。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述試劑盒還包括用于padlock-RCA反應(yīng)的試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒 的使用說明書中包括對(duì)用于定量檢測(cè)牛肉中豬肉成分的padlock-RCA擴(kuò)增的條件的描述。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的padlock探針成環(huán)連接反應(yīng)條件 是：60°Clhr，捕獲反應(yīng)的條件是：37°Clhr，RCA擴(kuò)增反應(yīng)的條件是37°Clhr。在一個(gè)具體 的實(shí)施方案中，本發(fā)明的用于檢測(cè)牛肉中豬肉成分的試劑盒還包括對(duì)照品。任選地，對(duì)照品 包括陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。在一個(gè)實(shí)施方案中，陰性對(duì)照為無菌雙蒸水。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了定量檢測(cè)牛肉中豬肉成分的 padlock-RCA-microscopy等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法，所述方法使用了本發(fā)明的寡核苷酸序列、 組合物或者試劑盒。該方法能在無需標(biāo)準(zhǔn)樣品，無需數(shù)字化PCR儀的情況下，對(duì)牛肉中豬肉 成分及其含量進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的特異性padlock寡核苷酸 探針、本發(fā)明寡核苷酸序列、組合物或者試劑盒在檢測(cè)牛肉中豬肉成分中的應(yīng)用。
[0015] 所述padlock-RCA-microscopy等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法包括步驟：
[0016] 1)獲得來自待測(cè)牛肉產(chǎn)品的總DNA樣品；
[0017] 2)使用牛padlock探針序列SEQIDNo. 1和豬padlock探針序列SEQIDNo. 2進(jìn) 行連接反應(yīng)，獲得環(huán)狀DNA序列；
[0018] 3)使用捕獲探針SEQIDNo. 3進(jìn)行捕獲反應(yīng)，將環(huán)狀DNA序列捕獲在固相；
[0019] 4)使用牛檢測(cè)探針序列SEQIDNo. 4和豬檢測(cè)探針序列SEQIDNo. 5在所述固相 上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，從而擴(kuò)增所捕獲的序列；
[0020] 5)通過熒光顯微鏡檢測(cè)擴(kuò)增序列。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的牛肉中豬肉成分的padlock-RCA-microscopy等溫 數(shù)字化檢測(cè)方法還進(jìn)一步包括對(duì)所述總DNA樣品進(jìn)行酶切。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶切過程使用Haelll酶。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，padlock-RCA-microscopy等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法還包括使用圖 像分析軟件對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行定量。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述padlock-RCA檢測(cè)方法檢測(cè)出10pM濃度下豬基因模板成 分的檢測(cè)限為0. 5%。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述padlock-RCA檢測(cè)方法檢測(cè)豬肉和牛肉混樣 中豬肉成分檢測(cè)限可達(dá)到〇. 5%。
[0025] 本發(fā)明的Padlock-RCA-microscopy方法通過探針識(shí)別牛和豬基因特異序列，連 接成環(huán)后通過熒光檢測(cè)探針進(jìn)行RCA滾環(huán)復(fù)制，加入后在熒光顯微鏡下直接對(duì)牛和豬分子 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行成像和計(jì)數(shù)，從而對(duì)樣品中豬成分進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
[0026] 本發(fā)明使用一種基于padlock-RCA的技術(shù)，能夠在等溫條件使特異性探針與目標(biāo) 序列雜交成環(huán)、復(fù)制。本發(fā)明即基于該技術(shù)原理，設(shè)計(jì)牛和豬特異性探針，優(yōu)化技術(shù)條件，建 立了能夠?qū)悠分信：拓i特異性基因片段比例進(jìn)行數(shù)字化檢測(cè)的技術(shù)，在無需標(biāo)準(zhǔn)樣品的 情況下，利用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的恒溫設(shè)備及熒光顯微鏡，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品的同時(shí)簡(jiǎn)單、快速、特 異且靈敏的定量檢測(cè)。另外，本發(fā)明的padlock-RCA法又無需數(shù)字化PCR儀和前處理試劑 盒，極大降低成本，能同時(shí)處理多個(gè)樣品，很大程度地提高方法通量。
【附圖說明】
[0027] 圖1是使用padlock-RCA等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法對(duì)合成的豬生長(zhǎng)激素基因靶序列 (A)、牛生長(zhǎng)激素基因靶序列（B)以及兩者的混合物（C)進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡成像使用20倍 視野。A圖是100%豬模板分子（濃度InM)。B圖是100%牛模板分子（濃度InM)。C圖是 豬和牛模板分子（濃度InM)等比例混合。
[0028] 圖2是不同比例混合豬、牛生長(zhǎng)激素基因靶序列模板分子時(shí)豬模板分子理論混合 比例和觀測(cè)值關(guān)系曲線。觀測(cè)值是利用padlock-RCA等溫?cái)?shù)字化檢測(cè)方法對(duì)樣品中豬和牛 模板分子進(jìn)行識(shí)別和成環(huán)復(fù)制后顯微鏡成像的分析結(jié)果，表示一個(gè)視野下豬模板分子在所 有分子中的比例平均值。該比值