一種用于同時(shí)檢測(cè)線粒體dna 4401a＞g和4435a＞g突變的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA4401A> G和4435A>G突變的試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年約有1730 萬(wàn)人死于心血管病，到2030年，幾乎有2330萬(wàn)人將死于心血管病，而高血壓是心血管疾病 的首位危險(xiǎn)因素。高血壓影響全世界超過(guò)三分之一的成年人，即大約10億人，每年造成全 世界900多萬(wàn)人死亡，其中半數(shù)死于心臟病和中風(fēng)，高血壓還可引起腎衰竭、盲癥、血管破 裂以及腦損傷。高血壓按照發(fā)病原因可以分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，原發(fā)性高血 壓約占所有高血壓的90-95%。
[0003] 線粒體是一種由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷 (ATP)的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，所以有"細(xì)胞動(dòng)力工廠"之稱。除了為細(xì)胞供能 外，線粒體還參與如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì) 胞周期的能力。
[0004] 線粒體基因是人體內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)。線粒體tRNA基因突變是與原發(fā)性 高血壓相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，2009年GuanMX等人發(fā)現(xiàn)，位于線粒體tRNAMet基因4435A >G突變與原發(fā)性高血壓相關(guān)（YuqiLiu，Min_XinGuanetal.Hypertention，2009;53: 1083-1090)，2011年又進(jìn)一步在細(xì)胞功能水平證明線粒體tRNAMet基因4435A>G可能影 響原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展（ZhongqiuLu，Min_XinGuanetal.EurJHumGenet，2011 ; 19 :1181-1186)〇
[0005] 目前對(duì)于突變檢測(cè)最常用方法為第一代測(cè)序測(cè)序技術(shù)，但此技術(shù)對(duì)儀器要求高， 操作繁瑣且成本昂貴，結(jié)果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP)是目前應(yīng)用較廣泛、相對(duì)成熟的檢測(cè)方法，但操作繁瑣，操作過(guò)程 中影響結(jié)果的不確定因素太多；近年來(lái)，變性高效液相色譜（DHPLC)和基因芯片的應(yīng)用為 點(diǎn)突變檢測(cè)提供了思路，檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異度均較高，自動(dòng)化程度高，適合高通量檢 測(cè)，但涉及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn) 易的突變篩查方法應(yīng)用與臨床突變篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過(guò)酶切法進(jìn)行線粒體DNA4401A>G和4435A>G突變檢測(cè)，克服了現(xiàn) 有方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作難、成本高等缺點(diǎn)，提供線粒體DNA4401A>G和4435A>G突變檢測(cè) 試劑盒，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種用于同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA4401A> 6和 4435A>G突變的方法，所述的方法包括以下步驟：
[0008] (1)提取全基因組DNA:運(yùn)用蛋白酶K消化裂解蛋白質(zhì)，酚-氯仿-異戊醇法，提取 全基因組DNA;
[0009] (2)特異性PCR擴(kuò)增：根據(jù)人類線粒體基因劍橋參考序列，線粒體引物6F、6R作為 巢式PCR的第一對(duì)引物，特異性擴(kuò)增mtDNA3796-4654位，全長(zhǎng)898bp，產(chǎn)物進(jìn)行純化后，接 著以純化后產(chǎn)物為模板，采用線粒體小引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作為巢式PCR的第二對(duì)引物， 特異性擴(kuò)增mtDNA4344-4577位，全長(zhǎng)234bp;
[0010] ⑶采用限制性內(nèi)切酶Blaf的特異性識(shí)別序列為CTAG回文結(jié)構(gòu)，限制性內(nèi)切酶 Nlalll的特異性識(shí)別序列為CATG回文結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，然后根據(jù)上述的特異性條帶對(duì)擴(kuò)增的 DNA進(jìn)行酶切；
[0011] (4)電泳鑒定：酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切產(chǎn)物DNA片段數(shù)量及大 小即可鑒定線粒體DNA是否發(fā)生4401A>G或4435A>G突變。
[0012] 所述的全基因組DNA從細(xì)胞、血液以及組織樣本中提取。
[0013] 一種所述的用于同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA4401A>G和4435A>G突變的方法的試劑 盒，所述的試劑盒包括提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、酶切反應(yīng)試劑、陽(yáng) 性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0014] 所述的取樣本全基因組DNA的試劑包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-異戊醇混 合液和溶液II，所述溶液I的主要成分為蛋白酶K，溶液II的主要成分為氫氧化鈉。
[0015] 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸 水。
[0016] 所述的酶切反應(yīng)試劑包括限制性內(nèi)切酶Blaf和Nlalll和酶切緩沖液。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA4401A> 6和 4435A>G突變的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明的所用標(biāo)本血液、尿液、組織等采集后仍可 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，如血液樣本可建立永生化類淋巴母細(xì)胞系、尿液細(xì)胞可用于成纖維細(xì) 胞培養(yǎng)、組織可用于誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的建立，可保存珍貴的遺傳資源本試劑盒借助特異 性PCR技術(shù)與專一性限制性內(nèi)切酶，利用雙酶切技術(shù)可直接根據(jù)酶切產(chǎn)物DNA片段數(shù)量及 大小同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA是否發(fā)生4401A>G或4435A>G突變。另外值得一提的是，本 試劑盒提供的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品可以對(duì)應(yīng)用本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，從 而更直觀、更清晰的分析檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明利用雙酶切技術(shù)可直接根據(jù)酶切產(chǎn)物DNA片段 數(shù)量及大小同時(shí)檢測(cè)線粒體DNA是否發(fā)生4401A>G或4435A>G突變。且酶切活性穩(wěn)定， 技術(shù)易掌握，且結(jié)果便于分析，檢測(cè)方便快速，必將成為臨床推廣原發(fā)性高血壓線粒體相關(guān) 突變的新方法，本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、易掌握；對(duì)儀器設(shè)備及操作人員無(wú)特殊要求，適 合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn)室開展。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為特異性條帶擴(kuò)增循環(huán)條件。（A. 6F和6R引物特異性條帶擴(kuò)增循環(huán)條件； B.Mt-Hp-F和Mt-Hp-R引物特異性條帶擴(kuò)增循環(huán)條件）
[0019] 圖2為突變樣本、對(duì)照樣本PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物圖。（其中圖2A為攜帶線粒體DNA 4401A>G突變樣本雙酶切產(chǎn)物電泳圖；圖2B為攜帶線粒體DNA4435A>G突變樣本雙酶 切產(chǎn)物電泳圖；圖2C為雙突變樣本雙酶切產(chǎn)物電泳圖；圖2D為不攜帶線粒體DNA4401A> G和4435A>G突變樣本雙酶切產(chǎn)物電泳圖；Μ為50bpDNALadder，泳道1為巢式PCR產(chǎn) 物，泳道2為酶切產(chǎn)物，泳道3為空白對(duì)照）
[0020] 圖3為突變樣本、對(duì)照樣本測(cè)序驗(yàn)證酶切方法圖。
[0021] 圖4為本發(fā)明檢測(cè)4401A>G和4435A>G突變?cè)韴D。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 1.DNA的提?。哼\(yùn)用酚-氯仿-異戊醇法提取血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜 刮片或唾液的樣本中的DNA。
[0023] 2.特異性引物設(shè)計(jì)及特異性條帶PCR擴(kuò)增：根據(jù)人類線粒體基因序列 (NC_012920. 1)采用文獻(xiàn)報(bào)道的線粒體引物6F、6R作為巢式PCR的第一對(duì)引物，特異性擴(kuò) 增mtDNA3796-4654位，全長(zhǎng)898bp。產(chǎn)物純化后，以其為模板，采用文獻(xiàn)報(bào)道的線粒體小 引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作為巢式PCR的第二對(duì)引物，特異性擴(kuò)增mtDNA4344-4577位，全長(zhǎng) 234bp，同樣對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0024] 3.專一性酶切及電泳鑒定：采用限制性內(nèi)切酶Blaf和Nlalll對(duì)上述特異性條帶 進(jìn)行酶切，酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即可鑒定是否發(fā)生4401A>G或4435A>G突 變。
[0025] 具體步驟如下：
[0026] 1.收集標(biāo)本：從細(xì)胞、血液以及組織樣本中快速提取全基因組DNA，針對(duì)采樣方 式、樣本來(lái)源以及樣本形式的不同，對(duì)不同樣本和樣本形式選擇相應(yīng)的方法進(jìn)行預(yù)處理，處 理方法如下：
[0027](1)收集樣品前準(zhǔn)備好滅菌的收集容器，每人250ml瓶子2瓶（內(nèi)有5ml雙抗）， 選擇晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮膚部位，收集150-200ml尿液，將尿液轉(zhuǎn) 移至50ml的離心管中，400g離心lOmin，棄上清，加10mlPBS，清洗一次，400g離心lOmin， 棄上清；
[0028] (2)指尖采血：用手指按摩采血部位，使中指或無(wú)名指指尖自然充血，再用醫(yī)用酒 精棉球消毒皮膚，待酒精揮發(fā)干燥后，右手持消毒刺針，自指尖腹側(cè)迅速刺入2mm，立即出 針，讓血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完畢，用消毒干棉 球壓住傷口片刻。靜脈采血：先用碘酊棉簽自所選靜脈穿刺處從內(nèi)向外、順時(shí)針?lè)较蛳?皮膚，待碘酊揮發(fā)后，再用醫(yī)用酒精棉簽以同樣方法拭去碘跡，然后左手拇指固定靜脈穿刺 部位下端，右手拇指和中指持注射器針筒，使針頭斜面和針筒刻度向上，沿靜脈走向使針頭 與皮膚成30度角快速刺人皮膚，然后以5度角向前穿破靜脈壁進(jìn)人靜脈腔，見回血后，將針 頭順勢(shì)探人少許。取50~100μ1血液標(biāo)本（如一滴血）或lcm2的血濾紙片放入1. 5ml Eppendorf管中，用PBS補(bǔ)至200μ1，室溫靜置10分鐘；
[0029] (3)收集組織前，要讓受檢者了解研究?jī)?nèi)容，并自愿同意參加試驗(yàn)的原則并簽訂 《知情同意書》。先用醫(yī)用酒精棉球從內(nèi)向外對(duì)采集皮膚處進(jìn)行消毒，然后涂上局部麻醉軟 膏，貼上麻醉貼，然后用采集皮膚組織的器具采集米粒大小的皮膚組織，將組織放入含有雙 抗的PBS溶液中。
[0030] 然后用細(xì)胞裂解液和溶液I對(duì)上述樣本進(jìn)行消化裂解，再用酚-氯仿-異戊醇沉 淀DNA，用乙醇清洗有機(jī)溶劑，最后用溶液II溶解DNA后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 2.特異性引物設(shè)計(jì)
[0032] 根據(jù)人類線粒體基因序列（NC_012920. 1)采用文獻(xiàn)報(bào)道的線粒體引物6F、6R作 為巢式PCR的第一對(duì)引物，特異性擴(kuò)增mtDNA3796-4654位，全長(zhǎng)898bp。線粒體小引 物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作為巢式PCR的第二對(duì)引物，特異性擴(kuò)增mtDNA4344-457