3253t＞c突變的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測線粒體tRNAUu(UUR)3253T> C突變的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年約有1730 萬人死于心血管病，到2030年，幾乎有2330萬人將死于心血管病，而高血壓是心血管疾病 的首位危險(xiǎn)因素。高血壓影響全世界超過三分之一的成年人，即大約10億人，每年造成全 世界900多萬人死亡，其中半數(shù)死于心臟病和中風(fēng)，高血壓還可引起腎衰竭、盲癥、血管破 裂以及腦損傷。高血壓按照發(fā)病原因可以分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，原發(fā)性高血 壓約占所有高血壓的90-95%。
[0003] 線粒體是一種由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷 (ATP)的主要場所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，所以有"細(xì)胞動(dòng)力工廠"之稱。除了為細(xì)胞供能 外，線粒體還參與如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì) 胞周期的能力。
[0004] 線粒體基因是人體內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)。線粒體tRNA基因突變是與原發(fā)性高 血壓相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，2009年GuanMX等人發(fā)現(xiàn)，位于線粒體tRNALeu(_基因4435A >G突變與原發(fā)性高血壓相關(guān)（YuqiLiu，Min_XinGuanetal.Hypertention，2009;53: 1083-1090)，2011年又進(jìn)一步在細(xì)胞功能水平證明線粒體tRNALeu(UUR)基因4435A>G可能影 響原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展（ZhongqiuLu，Min_XinGuanetal.EurJHumGenet，2011 ; 19 :1181-1186)〇
[0005]目前對于突變檢測最常用方法為第一代測序測序技術(shù)，但此技術(shù)對儀器要求高， 操作繁瑣且成本昂貴，結(jié)果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段 長度多態(tài)性（PCR-RFLP)是目前應(yīng)用較廣泛、相對成熟的檢測方法，但操作繁瑣，操作過程 中影響結(jié)果的不確定因素太多；近年來，變性高效液相色譜（DHPLC)和基因芯片的應(yīng)用為 點(diǎn)突變檢測提供了思路，檢測技術(shù)靈敏度和特異度均較高，自動(dòng)化程度高，適合高通量檢 測，但涉及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、操作簡 易的突變篩查方法應(yīng)用與臨床突變篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過酶切法進(jìn)行線粒體tRNA^(UUK)3253T>C突變檢測，克服了現(xiàn)有方法耗 時(shí)長、操作難、成本高等缺點(diǎn)，提供線粒體tRNA^(UUR)3253T>C突變檢測試劑盒，以及上述 方法或上述的試劑盒在檢測。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種用于檢測線粒體tRNAUu(UUR)3253T>C突變的 方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：
[0008] (1)提取全基因組DNA:運(yùn)用蛋白酶K消化裂解蛋白質(zhì)，酚-氯仿-異戊醇法，提取 全基因組DNA;
[0009] (2)特異性PCR擴(kuò)增及酶切：根據(jù)人類線粒體基因劍橋參考序列特異性設(shè)計(jì)一對 引物3253F、3253R，該引物特異性的擴(kuò)增含有3253位點(diǎn)的序列，然后利用專一性限制性內(nèi) 切酶BstEII特異性的識別GGTNACC回文結(jié)構(gòu)，3253位點(diǎn)堿基突變后，產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶 BstEII識別的回文結(jié)構(gòu)，利用限制性內(nèi)切酶BstEII識別的專一性，對樣本的全基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切；
[0010] (3)將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的DNA片段大小不同， 檢測線粒體tRNA^(UUR)基因3253位點(diǎn)是否發(fā)生突變。
[0011] 所述的全基因組DNA從細(xì)胞、血液以及組織樣本中提取。
[0012] -種所述的用于檢測線粒體tRNA^(UUR)3253T>C突變的方法的試劑盒，所述的試 劑盒包括提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、酶切反應(yīng)試劑、陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰 性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0013] 所述的取樣本全基因組DNA的試劑包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-異戊醇混 合液和溶液II，所述溶液I的主要成分為蛋白酶K，溶液II的主要成分為氫氧化鈉。
[0014] 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸 水。
[0015] 所述的酶切反應(yīng)試劑包括限制性內(nèi)切酶BstEII和酶切緩沖液。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種一種用于檢測線粒體tRNA^(UUK)3253T> C突變的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明的所用標(biāo)本血液、尿液、組織等采集后仍可用于后續(xù) 實(shí)驗(yàn)研究，如血液樣本可建立永生化類淋巴母細(xì)胞系、尿液細(xì)胞可用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、組 織可用于誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的建立，可保存珍貴的遺傳資源，本試劑盒借助特異性PCR技 術(shù)與專一性限制性內(nèi)切酶BstEII特異性的識別GGTNACC回文結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，每份DNA樣本用 1對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用專一性限制性內(nèi)切酶BstEII進(jìn)行1次酶切即可在幾 小時(shí)內(nèi)對線粒體tRNAUu(UUR)基因T3253C突變進(jìn)行檢測。另外值得一提的是，本試劑盒提供 的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品可以對應(yīng)用本試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，從而更直觀、 更清晰的分析檢測結(jié)果。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :特異性條帶擴(kuò)增循環(huán)條件。
[0018] 圖2 :突變樣本、對照樣本PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物圖（泳道8為Maker;泳道4、5、6、7 為突變樣本酶切產(chǎn)物；泳道1、2、3分別為正常樣本酶切產(chǎn)物）。
[0019] 圖3:突變樣本、對照樣本測序驗(yàn)證酶切方法圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 1.DNA的提?。哼\(yùn)用酚-氯仿-異戊醇法提取血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜 刮片或唾液的樣本中的DNA。
[0021] 2.特異性引物設(shè)計(jì)及特異性條帶PCR擴(kuò)增：使用Primer5. 0軟件根據(jù)人類線粒 體基因序列（NC_012920. 1)在3253前后設(shè)計(jì)上游引物3253F、下游引物3253R;采用上述引 物對包含3253的特異性條帶進(jìn)行擴(kuò)增。
[0022] 3.專一性酶切及電泳鑒定：采用專一性限制性內(nèi)切酶BstEII對上述特異性條帶 進(jìn)行酶切，酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即可鑒定是否發(fā)生3253T>C突變。
[0023] 具體步驟如下：
[0024] 1.收集標(biāo)本：在上述檢測線粒體tRNAUu(_基因T3253C突變的方法中，可從細(xì)胞、 血液以及組織樣本中快速提取全基因組DNA，針對采樣方式、樣本來源以及樣本形式的不 同，對不同樣本和樣本形式選擇相應(yīng)的方法進(jìn)行預(yù)處理，處理方法如下：
[0025] (1)收集樣品前準(zhǔn)備好滅菌的收集容器，每人251ml瓶子2瓶（內(nèi)有5ml雙抗）， 選擇晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮膚部位，收集150-200ml尿液，將尿液轉(zhuǎn) 移至50ml的離心管中，400g離心lOmin，棄上清，加10mlPBS，清洗一次，400g離心lOmin， 棄上清；
[0026] (2)指尖采血：用手指按摩采血部位，使中指或無名指指尖自然充血，再用醫(yī)用酒 精棉球消毒皮膚，待酒精揮發(fā)干燥后，右手持消毒刺針，自指尖腹側(cè)迅速刺入2mm，立即出 針，讓血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完畢，用消毒干棉 球壓住傷口片刻。靜脈采血：先用碘酊棉簽自所選靜脈穿刺處從內(nèi)向外、順時(shí)針方向消毒 皮膚，待碘酊揮發(fā)后，再用醫(yī)用酒精棉簽以同樣方法拭去碘跡，然后左手拇指固定靜脈穿刺 部位下端，右手拇指和中指持注射器針筒，使針頭斜面和針筒刻度向上，沿靜脈走向使針頭 與皮膚成30度角快速刺人皮膚，然后以5度角向前穿破靜脈壁進(jìn)人靜脈腔，見回血后，將針 頭順勢探人少許。取50~100μ1血液標(biāo)本（如一滴血）或lcm2的血濾紙片放入1. 5ml Eppendorf管中，用PBS補(bǔ)至200μ1，室溫靜置10分鐘；
[0027] (3)收集組織前，要讓受檢者了解研究內(nèi)容，并自愿同意參加試驗(yàn)的原則并簽訂 《知情同意書》。先用醫(yī)用酒精棉