一種集樣pcr檢測hbv的試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種集樣PCR檢測HBV的試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎（HB)是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的一種以肝臟損傷為主要特征的嚴(yán) 重危害人類和動(dòng)物健康的傳染病之一。HBV屬于嗜肝病毒科成員，迄今為止，發(fā)現(xiàn)的嗜肝 DNA病毒科有感染哺乳動(dòng)物的正嗜肝病毒，可感染人和猩猩等哺乳動(dòng)物，在黑猩猩、長臂猿、 地松鼠和樹駒等動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)；而另一類感染禽類和鳥類的禽是肝病毒屬在北京鴨、雪 雁和蒼鷺等也均有發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，近年來，有研究報(bào)道在鸚鵡、蝙蝠以及屠宰豬和雞 中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類HBV的存在。新的動(dòng)物種屬中HBV的發(fā)現(xiàn)表明HBV病毒可能出現(xiàn)變異或 重組、宿主范圍正日益擴(kuò)大，對人類的健康具有威脅性。因此，對HBV在動(dòng)物中的流行情況 進(jìn)行調(diào)查具有十分重要的意義。
[0003] 目前已有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)法檢測試劑盒投入市場，可用于血清學(xué)流行 病學(xué)調(diào)查。但對病毒的檢測，目前只能采用常規(guī)的PCR法進(jìn)行檢測?，F(xiàn)有的PCR檢測法雖 然具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但在進(jìn)行大量樣品檢測時(shí)，存在樣品處理費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，操作 繁雜，且浪費(fèi)試劑等缺陷，尤其是對于那些陽性率比較低的樣品篩查，亟待對其進(jìn)行優(yōu)化。
[0004] 目前，HBV流行病學(xué)調(diào)查主要依賴ELISA試劑盒進(jìn)行血清學(xué)診斷，但此方法僅可在 血清學(xué)水平對HBV進(jìn)行調(diào)查，不能反映病毒在動(dòng)物體內(nèi)的存在情況。同時(shí)，在樣品量較大 時(shí)，血清的處理和保存也成為制約ELISA檢測準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的因素之一。此外，由于試劑 盒本身的批次和廠家不同，其重復(fù)性和穩(wěn)定性也受到影響，商品化的試劑盒在成本方面也 不具有優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定多個(gè)待測樣本中哪些樣本感染乙型肝 炎病毒的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括單獨(dú)使用的引物對A、單獨(dú)使用的引物對B和記載PCR 擴(kuò)增方法的載體；
[0007] 或包括含有所述引物對A的PCR試劑、含有所述引物對B的PCR試劑和所述記載 PCR擴(kuò)增方法的載體；
[0008] 所述引物對A由序列表序列1所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組 成；
[0009] 所述引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組 成；
[0010] 所述PCR擴(kuò)增方法包括如下步驟：
[0011] 1)將多個(gè)待測樣本分為η組，且將每組中各待測樣本等質(zhì)量混合得到混合樣本， 每組待測樣本數(shù)相同，提取每組所述混合樣本的基因組DNA;
[0012] 2)以每組所述混合樣本的基因組DNA為模板，用所述引物對A進(jìn)行第一次PCR擴(kuò) 增，得到第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] 3)以所述第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述引物對B進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到 每組待測樣本的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測每組待測樣本的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，選取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物具有大小為281bp片段的待測樣本組；檢測每組待測樣本的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的方法為電泳檢測；
[0014] 4)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有大小為281bp片段的待測樣本組中的每個(gè)待測樣本分 別提取基因組DNA，分別重復(fù)步驟2)和3)，得到每個(gè)待測樣本的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 檢測每個(gè)待測樣本的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有大小為 281bp片段，則該待測樣本感染或候選感染HBV病毒；若第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不具有大小為 281bp片段，則該待測樣本未感染或候選未感染HBV病毒。
[0016] 上述試劑盒中，所述載體為說明書。上述方法中，檢測每個(gè)待測樣本的第二次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為電泳檢測或測序檢測；
[0017] 上述試劑盒中，所述含有所述引物對A的PCR試劑由PCR擴(kuò)增緩沖液、所述引物對 A和水組成；
[0018] 所述含有所述引物對B的PCR試劑由PCR擴(kuò)增緩沖液、所述引物對B和水組成。
[0019] 上述試劑盒中，所述引物對A和所述引物對B中的各條引物均為等摩爾混合；
[0020] 所述引物對A和所述引物對B中的各條引物在其所在所述PCR試劑中的濃度均具 體為0. 4μM。
[0021] 上述的試劑盒或由所述引物對Α和所述引物對Β組成的引物組或由所述含有所述 引物對A的PCR試劑和所述含有所述引物對B的PCR試劑組成的PCR試劑組在制備鑒定或 輔助鑒定多個(gè)待測樣本中哪些樣本感染乙型肝炎病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍。
[0022] 上述樣本為離體動(dòng)物組織或血清或膽汁；所述組織具體為肝臟。
[0023] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用集樣PCR檢測方法可對HBV流行病學(xué)調(diào)查中的組 織或血清以及膽汁樣品進(jìn)行PCR檢測，可以直觀的檢測到病毒在組織或血清以及膽汁中的 存在，在保證檢出率的同時(shí)可大大簡化前期的樣品處理時(shí)間以及后期試驗(yàn)中的操作步驟和 試劑的使用，尤其是在陽性率不高的情況下，可減少樣品處理時(shí)間和步驟，且節(jié)省試劑開 支，為快速準(zhǔn)確調(diào)查疾病的流行情況提供了技術(shù)支撐。同時(shí)克服了血清學(xué)檢測中假陽性、假 陰性的出現(xiàn)，為HBV流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)支撐。本方法在臨床診斷、監(jiān)測，科研及 大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查中可廣泛使用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為集樣法PCR檢測結(jié)果
[0025] 圖2為集樣檢測陽性樣品的單獨(dú)檢測
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)
[0029] 針對HBV保守序列進(jìn)行比對，設(shè)計(jì)2對簡并引物S1-F/S1-R和S2-F/S2-R，建立HBV 檢測的巢氏PCR方法，具體序列為表1 ;
[0030] 表1為HBVPCR擴(kuò)增引物序列
[0031]
[0032]實(shí)施例2、引物用于集樣法PCR檢測HBV
[0033] -、集樣法待測樣本的制備
[0034] 采集屠宰雞肝臟樣品共32例，做好標(biāo)記，置_80°C保存。
[0035] 將每4例待檢樣品分別約100mg置研缽中，加入液氮研磨等質(zhì)量混勻，后用1. 5ml 離心管取集樣混合研磨組織l〇〇mg左右進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，共8組待測混合樣品，各集樣混合樣 品做好標(biāo)記以備二次檢測使用。
[0036] 一組：編號為13-16、二組：編號為17-20、三組：編號為1-4、四組：編號為21-24、 五組：編號為25-28、六組：編號為5-8、七組：編號為9-12、八組：編號為29-32。上述32個(gè) 樣本中已知編碼為1、5、8、13的樣本感染HBV，其余均未感染。
[0037] 二、集樣法PCR
[0038] 1、基因組DNA提?。ㄒ钥禐槭兰o(jì)通用柱式DNA提取試劑盒為例說明）：
[0039] 1)向每組含有待測混合樣品lOOmg的離心管中，加入180μlBufferGTL，同時(shí)做好 標(biāo)記；
[0040] 2)加入蛋白酶K(Prote