用于預防和/或治療眼科疾病的方法的修飾的TGF-β寡核苷酸的制作方法
【專利說明】用于預防和/或治療眼科疾病的方法的修飾的TGF-β寡核 苷酸
[0001] 本發(fā)明涉及用于預防和/或治療眼科疾病的方法的TGF-β寡核苷酸，其包含橋接 核苷酸，聚環(huán)氧烷、2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修飾的核苷酸。 技術背景
[0002] 轉化生長因子β(TGF-β)是一種例如控制增殖或細胞分化的多功能生長因子， 其是涉及發(fā)育或組織修復的生理或病理過程中調控眼組織中細胞行為的最重要配體之一， 雖然還涉及多種其他生長因子。該配體活性增加可誘導不利的炎性應答和組織纖維化。在 哺乳動物中，已知三種TGF-β的同種型，S卩β1、β2和β3。在大多數(shù)情況中，TGF-β增強 胞外基質生產(chǎn)并抑制細胞增殖。此外，TGF-β能夠誘導多種生長因子，即結締組織生長因 子（CTGF)、血小板衍生生長因子（PDGF)、成纖維細胞生長因子（FGF)和血管內皮生長因子 (VEGF)以及TGF-βΙ本身。所有這些因子都在損傷后的正常組織恢復中具有重要作用。
[0003] 潤濕內部眼結構（角膜內皮、虹膜、晶狀體、小梁網(wǎng)和視網(wǎng)膜）的水狀液含有多種 細胞因子和生長因子。TGF-β(特別是TGF-I3 2)是主要的細胞因子。生理上，TGF-β主 要以潛伏、無活性的形式產(chǎn)生于睫狀體上皮和晶狀體上皮，該形式由成熟TGF-β、潛伏相 關肽（LAP)(小潛伏形式）和潛伏-TGF-β-結合蛋白（LTBP)組成。已在人和動物中報道 了晶狀體中各TGF-β同種型的異質性表達模式。在多種眼科疾病的臨床期間，水狀液中 TGF-β2的濃度發(fā)生變化。例如，在具有增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR)(-種后視網(wǎng)膜脫 落和視網(wǎng)膜纖維化的疾?。┑难壑校Ａw中TGF-β2的濃度隨著視網(wǎng)膜纖維化的進展而 升高。與正常對象相比，糖尿病性視網(wǎng)膜病變和開角型青光眼的患者中總TGF-β2和活性 TGF-β2的濃度也較高。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜微血管的慢性阻塞誘導VFGF上 調和巨噬細胞的趨化作用（TGF-β的主要來源KVEGF和TGF-β聯(lián)合誘導視網(wǎng)膜新血管形 成和圍繞這些新血管的纖維化，這會潛在導致視網(wǎng)膜脫落或出血。升高的TGF-β2水平誘 導小梁網(wǎng)細胞中基質表達和沉積，導致青光眼中排水路徑的阻塞和眼內壓的升高。在各實 施例中，TGF-β都在疾病發(fā)生中起作用。在具有假性表皮脫落綜合征（pseudoexforiation syndrome)(-種類型的青光眼，其在晶狀體、虹膜或小梁網(wǎng)上具有表皮脫落材料沉積）的 眼中，TGF-β1的水平升高，但TGF-β1在該疾病發(fā)病機理中的確切作用仍然未知（參見 ShizuyaSaika,LaborartoryInvestigation(2006)，86, 106-115)〇
[0004]TGF-β是胞外基質產(chǎn)生和沉積的最有力調控因子之一。其通過兩種主要機制刺 激胞外基質的產(chǎn)生并影響其粘附性質。首先，TGF-β刺激成纖維細胞和其他細胞產(chǎn)生胞外 基質蛋白和細胞粘附蛋白，包括膠原、纖連蛋白和整聯(lián)蛋白。其次，TGF-β減少降解胞外基 質的酶（包括膠原酶、肝素酶和間質溶解素）的產(chǎn)生，并增加抑制降解胞外基質的酶的蛋白 質（1型纖溶酶原激活物抑制劑和金屬蛋白酶的組織抑制劑）的產(chǎn)生。這些變化的凈作用 是增加胞外基質蛋白的產(chǎn)生并以細胞特異性方式提高或降低細胞的粘附性質（參見Blobe GC等，2000 年 5 月，〃Roleoftransforminggrowthfactorbetainhumandisease(人 疾病中轉化生長因子β的作用）〃，N.Engl.J.Med. 342 (18)，1350-1358)。
[0005] 已提出靶向TGF-β作為例如青光眼中的潛在治療性措施?？紤]到 TGF-β在青光眼發(fā)病機理中的多個方面，治療應涉及調節(jié)其產(chǎn)生、激活、與受體相 互作用、下游胞內調節(jié)機制和/或最終結構和ECM變化（參見PrendesMA等，BrJ Ophthalmol(2013)，97, 680-686)。
[0006] 基于慢性增加的眼內壓，青光眼（GCM)是一種以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的進行性 缺失為特征的進行性視神經(jīng)病變，其在臨床上體現(xiàn)為視神經(jīng)盤神經(jīng)視網(wǎng)膜邊緣組織缺 失、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層中的缺陷和功能性視域測試的缺陷（參見Danesh-Meyer等， Ophthalmol. 2006, 113:603-611)。青光眼是美國成人中失明的第二大主要原因。雖然有多 種治療選擇（包括難治患者中的手術過程），但失明仍是一種主要威脅。原發(fā)性開角型青光 眼（P0AG)是美國國內青光眼的最常見形式。在世界范圍內，2000年時患有P0AG的人數(shù)預 測為6680萬人，其中670萬人雙側失明（參見Quingley，BrJOphthalmol. 1996年5月； 80(5) :389-393) 〇
[0007] 白內障手術是最常見的眼科手術過程。僅僅在美國，每年進行最多300萬例白 內障手術。目前美國政府每年花費超過30億美元用于治療白內障（僅醫(yī)保患者）。通 過手術移除眼的晶狀體，并植入眼內晶狀體。晶狀體囊維持在原位，且該囊的前半部 分經(jīng)常由于機械破壞和晶狀體替換相關的其他潛在因素而發(fā)生后囊膜混濁（PC0)。該 病癥出現(xiàn)在20至40 %的PC0患者中，在最初的兩年內進行YAG-激光后囊膜切開術 (比率取決于國家、使用的晶狀體類型和手術經(jīng)驗）以除去混濁（參見JohanssonB 等，BrJOphthalmol(2010) ,94, 450-455;MathewRG等，OphthalmicSurgLasers Imaging(2010)，41，651-655)。使用YAG-激光與各種風險相關，包括視網(wǎng)膜脫落（1-3% )、 黃斑水腫（最高5%)和繼發(fā)性青光眼（參見BillotteC和BerdeauxG，JCataract RefractSurg(2004), 30(10), 2064-2071)〇
[0008]TGF-β與GCM和PC0的病理生理密切相關；迄今為止，已通過ALK5抑制劑（例 如參見W0 2009/146408)或針對TGF-β的抗體（即其同種型之一，其公開于例如TO 2012/167143)來抑制TGF-β蛋白的作用。迄今為止，這些化合物無一能夠成功地在眼中抑 制TGF-β并因此成功預防和/或治療諸如GCM或PC0的眼科疾病。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種寡核苷酸，優(yōu)選反義寡核苷酸，其特異性抑制TGF-β1、 TGF-β2 和 / 或TGF-β3mRNA，TGF-β1 和TGF-β2mRNA或TGF-β1 和TGF-β3mRNA或 TGF-β2和TGF-β3mRNA的表達，并因此能夠高度有效地用于預防和/或治療眼科疾病而不 導致任何（嚴重的）副作用。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明涉及使用一種TGF-β寡核苷酸（優(yōu)選TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 反義寡核苷酸）的用途，其用于治療眼科疾?。ǜ裳鄄　⑶喙庋刍蚝竽夷せ鞚幔┑姆椒ㄖ?。
[0011] 該TGF-β寡核苷酸由SEQIDNO. 1的TGF-β1核酸序列（參見圖1)或SEQID Ν0· 2的TGF-β2核酸序列（參見圖2)或SEQIDΝ0· 3的TGF-β3核酸序列（參見圖3) 的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾 的。本發(fā)明的一些寡核苷酸對應于TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，或TGF-β1和TGF-β2或 TGF-β1和TGF-β3或TGF-β2和TGF-β3,且與這些序列中的一種或多種雜交。
[0012] 具體而言，用于本發(fā)明的寡核苷酸包含SEQIDNO. 2的第1380-1510號核酸區(qū)域 的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng) 修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β2表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核 苷酸包含或由以下序列組成：SEQIDN0. 5 (如ASPH36:GACCAGATGCAGGA)、SEQIDN0. 6 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDNO. 7(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)，SEQIDNO. 8(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或SEQIDΝ0·9(如ASPH121 或ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQIDN0·10(如ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQIDN0·11(如ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQIDΝ0·12(如ASPH26 或ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQIDΝ0·13(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQIDNO. 14(如ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·15(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·16(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或SEQIDNO. 34(如ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2740-2810號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該 寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β2 表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列組成：SEQIDN0. 60(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQIDΝ0·76(如ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或SEQID NO. 106(如ASPH115:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDN0.2的 TGF-β2核酸序列的第1660-1680號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低 和抑制TGF-β1和/或TGF-β2表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或 由以下序列組成：SEQIDN0. 17(如ASHP01 或ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQID NO. 18(如ASPH03 或ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQIDNO. 19(如ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或SEQIDΝ0· 20(如ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2390-2410號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個，最優(yōu)選13個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑 制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由 以下序列組成：SEQIDΝ0. 21 (如ASPH9 或ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核 苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 (且 最優(yōu)選TGF-β2)表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列之一組成： SEQIDΝ0. 22-59、61-75、77-105、107-140 (例如ASHP11-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-ASPH64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-ASPH118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或T-LNA(SEQIDN0:144))。
[0017] 本發(fā)明中優(yōu)選的寡核苷酸分別是ASPH01、ASPH03、ASPH05、ASPH17、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192和ASPH193。
[0018] 本發(fā)明中其他優(yōu)選的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其優(yōu)選抑制 TGFf3 ImRNA的表達和/或活性。該組中優(yōu)選的寡核苷酸分別是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPH1106、ASPH1139、ASPH1150、ASPH1162、ASPH1163、ASPH1175、ASPH1178和 ASPH1181。
[0019] 在替代性實施方式中，寡核苷酸優(yōu)選抑制TGFi3 3mRNA的表達和/或活性。這 類寡核苷酸分別是例如ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065和ASPH2066。
[0020] 本發(fā)明的寡核苷酸顯示對TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的強且特異性抑制。或者，本發(fā)明的寡核苷酸顯示對TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情況下顯示對TGF- β 1、TGF- β 2和 TGF-β 3的強且特異性抑制。
[0021] 本發(fā)明的核苷酸中的一個或多個核苷酸的修飾選自LNA、ΕΝΑ、聚環(huán)氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0_甲氧基和2'-0_甲基。這些修飾優(yōu)選位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含這類修飾的核苷酸的寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0022] 修飾的核苷酸是排列為例如一列（彼此緊鄰）或不同的模式（此時一個或多個未 修飾的核苷酸在一個修飾的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一個或多個修飾的核苷酸起始， 隨后是一個或多個（如一個、兩個、三個或四個）未修飾的或未鎖定的（unlocked)核苷酸， 隨后再是一個或多個修飾的核苷酸。在一個實施方式中，該核苷酸的兩端都包含相同模式 的修飾的和未修飾的或未鎖定的核苷酸。在另一個實施方式中，3'和5'端的修飾模式不 同，包括一端不包含修飾的核苷酸。優(yōu)選地，修飾的寡核苷酸包含一系列8或9個未鎖定的 核苷酸。
[0023] 或者，該寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者該寡核苷酸的5'和/或3' 端處和該寡核苷酸中的任何其他位置的至少一個核苷酸是經(jīng)修飾的。例如，ASPH1071、 ASPH1100、ASPH1109、ASPH1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPH1126、ASPH1127和ASPH1128屬 于一組TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含處于不同模式（例如由未鎖定的 核苷酸隔開彼此）中的修飾的核苷酸（如LNA、ENA等）。這些寡核苷酸包含一種類型的修 飾，或一種或多種不同的修飾。任選地，寡核苷酸的兩個連續(xù)核苷酸（修飾或未修飾的）之 間的至少一個磷酸連接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本發(fā)明涉及TGF-β反義寡核苷酸，其與超過一種TGF-β同種型相互作用并 抑制其表達，即使在寡核苷酸與TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100%互補的情況 下也是如此。這類反義寡核苷酸分別是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。 這些寡核苷酸優(yōu)選與相同或不同物種（如人、猴、大鼠或小鼠）的TGF-β序列相互作用，例 如分別是ASPH1131 和ASPH1132。
[0025] 不同實施方式的所有寡核苷酸均用于預防和/或治療眼科疾病的方法，這些眼 科疾病是例如干眼病、青光眼、后囊膜混濁（PC0)、成視網(wǎng)膜細胞瘤、脈絡膜癌、馬凡或洛伊 斯-迪茨綜合征、黃斑變性（如衰老相關的黃斑變性、糖尿病黃斑水腫或白內障）。
【附圖說明】
[0026]圖 1 顯示人 TGF-βImRNA 的核酸序列（ΝΜ_000660· 4)。
[0027]圖 2 顯示人 TGF-β 2mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028]圖 3 顯示人 TGF-β 3mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003239· 2)。
[0029] 圖4顯示核苷酸修飾的示例。
[0030] 圖5a)至5c)顯示人Α172神經(jīng)膠質瘤細胞中TGF-β1和TGF-β2mRNA表達的抑 制。以10nM的劑量使用不同的修飾的寡核苷酸轉染A172細胞（在轉染試劑存在的情況 下），并在轉染后24小時測量TGF-β1 (白色柱）和TGF-β