磷酸肌酸類化合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種憐酸肌酸類化合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 憐酸肌酸是一種含有高能憐酸鍵化合物，在肌肉收縮的能量代謝中發(fā)揮重要作 用。它是屯、肌和骨骼肌的化學(xué)能量儲備，并用于ATP的再合成。臨床上采用肌肉注射或靜 脈注射外源性憐酸肌酸二鋼鹽來治療缺血狀態(tài)下的屯、肌代謝異常，W及在屯、臟手術(shù)時(shí)將憐 酸肌酸二鋼鹽加入屯、臟停搏液中保護(hù)屯、肌。憐酸肌酸二鋼鹽作為屯、肌保護(hù)劑藥品已經(jīng)在國 內(nèi)外已上市應(yīng)用多年。
[0003] 目前外源性憐酸肌酸的制備方法有化學(xué)合成法、生物提取法和酶法。生物提取法 和酶法由于成本高、相對效率較低等原因，一定程度上限制了其應(yīng)用。用化學(xué)合成法制備 憐酸肌酸是目前獲得外源性憐酸肌酸的一個(gè)主要途徑，其中W肌酢為原料合成憐酸肌酸的 方法（專利200710038838.訝是目前應(yīng)用最廣的方法之一。在W肌酢為原料生產(chǎn)憐酸肌酸 時(shí)，肌酢與=氯氧憐縮合反應(yīng)過程中會有副反應(yīng)，該副反應(yīng)產(chǎn)物隨后續(xù)工藝過程，最終形成 與憐酸肌酸鋼極性近似的水溶性副產(chǎn)物，易于混到產(chǎn)品中影響終產(chǎn)品質(zhì)量，目前對副反應(yīng) 產(chǎn)物的檢測未見有文獻(xiàn)報(bào)道。
[0004] 憐酸肌酸目前在臨床上最主要的用途，是制成注射用憐酸肌酸鋼。注射劑相比其 它劑型，對產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性有更高的要求。對憐酸肌酸鋼粗品及成品中因副反應(yīng)產(chǎn)生 的雜質(zhì)化合物進(jìn)行檢測，并對之在終產(chǎn)品中實(shí)現(xiàn)有效控制，有助于提高藥品質(zhì)量穩(wěn)定性和 臨床用藥安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明主要提供了一種憐酸肌酸類化合物及其應(yīng)用，確定了憐酸肌酸鋼粗品及終 產(chǎn)品中化合物Ia的具體結(jié)構(gòu)，能加強(qiáng)對憐酸肌酸鋼質(zhì)量的有效控制。其技術(shù)方案如下：
[0006] 一種憐酸肌酸二鋼鹽中雜質(zhì)化合物的高效液相色譜檢測方法，所述雜質(zhì)化合物具 有如下式（Ia)所示的結(jié)構(gòu)：
[0007]
[0008] W肌酢為原料生產(chǎn)憐酸肌酸鋼，是當(dāng)前主流的生產(chǎn)工藝之一。我們在質(zhì)量提升研 究過程中，發(fā)現(xiàn)了化合物Ia,它是工藝過程中一個(gè)主要的副產(chǎn)物。該化合物的結(jié)構(gòu)，從未見 過文獻(xiàn)報(bào)道，推斷經(jīng)由W下的途徑生成：
[0009]
[0010] 該化合物的理化性質(zhì)和憐酸肌酸鋼接近，易于混在終產(chǎn)品中影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此 有必要對粗品及終產(chǎn)品中的化合物Ia進(jìn)行含量檢測，控制該成分的含量W保證產(chǎn)品質(zhì)量。
[0011] 具體檢測條件及檢測方法為： 陽〇1引檢測條件如下
[0013]W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相中W乙臘或甲醇為有機(jī)相、W緩沖鹽 及離子對試劑的水溶液為水相，檢測器為紫外檢測器。
[0014] 其中，有機(jī)相與水相的體積比為0-40:60-100,優(yōu)選的，為20:80。
[0015] 優(yōu)選的，有機(jī)相為乙臘。
[0016] 優(yōu)選的，水相中緩沖鹽為憐酸二氨鋼或憐酸二氨鐘，離子對試劑為四下基氨氧化 錠或四下基漠化錠或十二烷基S甲基氯化錠，抑為4-8 ;更優(yōu)選的，水相中緩沖鹽含量為 0. %，離子對試劑含量為0.1 wt%，抑為6. 3-6. 8。
[0017] 紫外檢測波長為210皿。 引檢測方法：
[0019] 對照品：Wla、扣、Ic或Id為對照品，扣、1C、Id具有式（I)所示的結(jié)構(gòu)通式：
[0020]
陽02U 其中，Ml選自化和K中的任一種，M2選自化、K和H中的任一種對于扣，Ml為 化，M2為H;對于Ic,Ml為K，M2為K;對于Id,Ml為K，M2為H;
[0022]la、扣、Ic和Id的制備方法如下： 陽02引 （I)Ia的制備
[0024] 富集副產(chǎn)物的憐酸肌酸二鋼鹽粗品，加甲醇超聲處理兩次，傾去上層，沉淀加水 使溶解，再加入甲醇或乙醇，攬拌均勻，過濾，濾液于0~10°c放置結(jié)晶，再用水-甲醇或 水-乙醇重結(jié)晶一次，濾出，干燥，即可得化合物Ia純品，純度大于98% ; 陽0巧](2)扣的制備
[0026]取化合物Ia加水溶解，用IM肥1調(diào)PH至3~4,加入乙醇攬，抽濾，即得化合物 扣；
[0027] (3)Ic的制備
[0028] 將由肌酢和=氯氧憐縮合反應(yīng)得到的肌酢憐酷氯，邊攬拌邊緩慢加入到質(zhì)量濃度 為20 %的KOH溶液中，攬拌過夜，用鹽酸調(diào)PH至7~8,攬拌下加入溶液體積4倍量的乙 醇，靜置數(shù)小時(shí)后，抽濾，得到憐酸肌酸鐘粗品，富集副產(chǎn)物后，加甲醇超聲處理兩次，傾去 上層，沉淀加水使溶解，再加入甲醇或乙醇，攬拌均勻，過濾，濾液于0~l〇°C放置結(jié)晶，再 用水-甲醇或水-乙醇重結(jié)晶一次，濾出，干燥，即得到化合物Ic純品；
[0029] (4)Id的制備
[0030] 取化合物Ic加水溶解，用IM肥1調(diào)PH至3~4,加入乙醇攬拌，抽濾，即得化合物 Ido
[0031] 具體檢測方法一： 陽03引取la、扣、Ic或Id純品，溶解于流動相中，分別制成50yg/ml的對照液1和5yg/ml的對照液2 ;取待測樣品溶解于流動相中，配制成5mg/ml的待測液；待測液為憐酸肌酸 鋼粗品時(shí)使用對照液1，分別吸取20y1的對照液1和待測液注入液相色譜儀，測定憐酸肌 酸鋼粗品中Ia的含量；待測液為憐酸肌酸鋼精制品時(shí)使用對照液2,分別吸取20y1的對 照液2和待測液注入液相色譜儀，測定憐酸肌酸鋼精制品中Ia的含量。
[0033] 具體檢測方法二：
[0034] 參考專利201310227572. 9用離子色譜法，電導(dǎo)檢測器來測定。使用陰離子交換色 譜柱，W氨氧化鐘溶液為流動相，流速為每分鐘0. 5~1. 5ml，電導(dǎo)檢測器，抑制電流80~ 100mA，柱溫 15 ~35°C。
[0035] 對照品溶液制備：取化合物la、Ib、Ic或Id純品適量，精密稱定，用純化水分別制 成每Iml含20yg的溶液[對照品溶液1]和每Iml含2. 0yg的溶液[對照品溶液2]，即 得（濃度均按無水物計(jì)算）。
[0036] 供試品溶液的制備：精密稱取憐酸肌酸鋼相關(guān)樣品適量，用純化水溶解并配成 2mg/ml的溶液，即得。
[0037] 測定：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各25y1，注入離子色譜儀，測定， 即得。測定憐酸肌酸鋼粗品時(shí)使用對照品溶液1，測定憐酸肌酸鋼精制品時(shí)使用對照品溶液 2。
[0038] 上述憐酸肌酸類化合物在憐酸肌酸鋼質(zhì)量控制中能夠發(fā)揮應(yīng)用作用。
[0039] 采用上述憐酸肌酸二鋼鹽中雜質(zhì)化合物的高效液相色譜檢測方法，本發(fā)明具有W 下優(yōu)點(diǎn)：
[0040] 新發(fā)現(xiàn)了W肌酢為原料生產(chǎn)憐酸肌酸鋼的主要副產(chǎn)物即化合物Ia,并制備了類似 化合物扣、Ic和Id,并W之來控制易于進(jìn)入終產(chǎn)品的化合物Ia的含量，能加強(qiáng)對憐酸肌酸 鋼質(zhì)量的有效控制，有助于提高臨床用藥的安全性和有效性；
[0041] 本發(fā)明提供了一種檢測憐酸肌酸鋼副產(chǎn)物雜質(zhì)Ia的高效液相檢測方法，來控制 粗品及終產(chǎn)品中化合物Ia的含量，能加強(qiáng)對憐酸肌酸鋼質(zhì)量的有效控制，有助于提高臨床 用藥的安全性和有效性。
【附圖說明】
[0042] 圖I和圖2為化合物Ia的結(jié)構(gòu)圖；
[0043] 圖3為測定憐酸肌酸鋼粗品中雜質(zhì)Ia的HPLC色譜圖； W44] 圖4為測定憐酸肌酸鋼精制品中雜質(zhì)Ia的HPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 具體實(shí)施例 陽046] 實(shí)施例1
[0047] 化合物Ia的制備
[0048] 取經(jīng)富集副產(chǎn)物的憐酸肌酸鋼粗品60g，加入200ml甲醇超聲約5min，放置，傾去 上層液體，沉淀再同樣處理一次，傾去上層液體，沉淀加入HOml水使溶解，再加入420ml甲 醇，攬拌均勻，過濾，濾液于l〇°C放置結(jié)晶，次日過濾，得晶體11.Og,加30ml水和100mL甲 醇重結(jié)晶一次，濾出晶體，室溫鼓風(fēng)干燥2小時(shí)，得到7.6克，用實(shí)施例8中的HPLC方法檢 測純度，純度為98. 6% (面積歸一法）。 W49] 實(shí)施例2
[0050] 化合物Ia的結(jié)構(gòu)確證 陽05U 樣品來源；
[0052] 實(shí)施例1得到的化合物Ia純品。X衍射測試所用的單晶來自實(shí)施例1重結(jié)晶過程 中挑選出的單晶。 陽05引測試內(nèi)容：
[0054]IHNMR;31PNMR;ESI質(zhì)譜；ESI高分辨質(zhì)譜；X單晶衍射；卡爾一費(fèi)休氏法測定水 分。 陽〇55] 測試結(jié)果：
[0056] A:?NMR值2〇, 400M)，5 3. 82 (2H,S,邸2)，2. 82 (3H,S,邸3)。
[0057] B:3中NMRa)2〇, 400M)，5 -0. 15, 5 -9. 69,（未用憐酸做參比），兩單峰積分比例為 1:1。
[0058]C:ESI質(zhì)譜（正離子），出現(xiàn)361. 8[M+Na]+離子峰和700. 8巧M+Na] +離子峰。
[0059] D:ESI(正離子）高分辨質(zhì)譜。 I；0060] 表1結(jié)果
[0061]
[0062] E:X單晶衍射結(jié)果顯示的結(jié)構(gòu)，見圖1和圖2,單晶晶體數(shù)據(jù)見表2所示：
[0063] 表2化合物Ia的8水合物單晶的晶體數(shù)據(jù)
[0064]
W65]F:卡爾-費(fèi)休氏法測定水分結(jié)果：30. 06%。
[0066] 解析：?NMR譜中顯示邸2[S3. 82, 2個(gè)H,單峰]和邸3[S2. 82, 3個(gè)H,單峰]的 信號，其化學(xué)位移值與憐酸肌酸中相應(yīng)的化學(xué)位移值接近，表明含有肌酸或肌酢結(jié)構(gòu)片段。 憐譜中，顯示兩個(gè)1 :1的單峰，表明含有兩個(gè)化學(xué)環(huán)境不同的憐酸根基團(tuán)。ESI質(zhì)譜顯示了 分子加鋼離子峰及相應(yīng)2倍離子峰，ESI高分辨質(zhì)譜顯示的分子式與X單晶衍射得到的結(jié) 果完全相符。X單晶衍射顯示含8個(gè)結(jié)晶水，含8個(gè)結(jié)晶水時(shí)，水分含量理論值為29. 81 %， 運(yùn)與卡爾-費(fèi)休氏法測定水分的結(jié)果非常接近，，兩者結(jié)果能相互印證。因此化合物Ia的 8水合物的立體結(jié)構(gòu)為如圖1、圖2所示。
[0067] 實(shí)施例3
[0068] 化合物Ia的不同干燥條件與結(jié)晶水含量
[0069] 取實(shí)施例1中得到的晶體2份，每份0.5克，精密稱定后，按照下面的方法進(jìn)行干 燥：1、40°C鼓風(fēng)干燥3小時(shí)；2、60°C鼓風(fēng)干燥2小時(shí)。于干燥器中冷卻至室溫后，精密稱定 重量，按照實(shí)施例8中的HPLC條件測定純度，計(jì)算失重及干燥后結(jié)晶水含量n。結(jié)果如下 表： 陽070] 表3化合物Ia的結(jié)晶水含量
[0071]

陽072] 實(shí)施例4 陽07引化合物扣的制備 陽074] 取化合物Ia0. 5克，加入2ml水溶解，用IM肥1調(diào)PH至3~4,加入IOml乙醇， 攬拌1小時(shí)，抽濾，得化合物Ib，40°C鼓風(fēng)干燥3小時(shí)，得0. 45克。 陽〇7引用實(shí)施例8中的HPLC方法檢測純度，98. 7 % (面積歸一法）。ESI質(zhì)譜（正離 子）：340. 3[M+Na]\卡爾-費(fèi)休氏法測定水分：10. 94%。
[0076]實(shí)施例5陽077] 化合物Ic的制備
[0078] 將由肌酢和=氯氧憐縮合反應(yīng)得到的肌酢憐酷氯，在攬拌下緩慢加入到體積濃度 20%KOH溶液中，攬拌過夜，用鹽酸調(diào)PH7~8,攬拌下加入溶液體積4倍量的乙醇，靜置數(shù) 小時(shí)后，抽濾，得到憐酸肌酸鐘粗品，富集副產(chǎn)物后，再用與實(shí)施例1中相似的方法處理，得 到化合物Ic純品。
[0079] 用實(shí)施例8中的HPLC方法檢測純度，99. 1 % (面積歸一法）。ESI質(zhì)譜（正離 子）：410. 5[M+Na]\卡爾-費(fèi)休氏法測定水分：16. 21%。
[0080] 實(shí)施例6
[0081] 化合物Id的制備 陽0間取化合物Ic0. 5克，加入2ml水溶解，用IM肥1調(diào)PH至3