海洋芽孢桿菌、分離方法、海洋右旋糖苷酶制備方法及應(yīng)用
【專利說明】海洋芽抱桿菌、分離方法、海洋右旋糖昔酶制備方法及應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及微生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種海洋芽抱桿菌、其分離方法、海洋 右旋糖巧酶的制備方法W及它們口腔護(hù)理、日化方面的應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】 陽00引右旋糖酢酶（dextranase,EC3. 2. 1. 11)是專一'性切割a-1,6糖巧鍵葡聚糖中a-1,6糖巧鍵的酶。按切割方式分類將右旋糖酢酶分成外切型和內(nèi)切型。右旋糖酢是一種 葡萄糖分子Wa-1,6糖巧鍵為主鏈，同時含有少量a-1,3、a-1,4等糖巧鍵構(gòu)成的支鏈， 而形成的葡聚糖大分子。外切型右旋糖酢酶從右旋糖酢的非還原端開始，逐一將葡萄糖分 子切割下來，其終產(chǎn)物為葡萄糖分子及無法切割的部分；內(nèi)切型右旋糖酢酶在右旋糖酢分 子的內(nèi)部隨機(jī)切割，生成少量的葡萄糖和異麥芽寡糖。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)霉菌、酵母菌和細(xì)菌都能 產(chǎn)生右旋糖酢酶。
[0003] 1968年Fitzgerald首次報(bào)道了右旋糖酢酶在離病防治方面的可行性，自此多國 科學(xué)家參與研究，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)、體外人工牙菌斑實(shí)驗(yàn)，最終證明此酶確實(shí)有抑制牙菌斑生 物膜形成的作用。1969年Gibbons和Keyes在倉鼠的飲用水中加入右旋糖酢酶，在離病防 治中效果明顯。2004年，Wiater等人研究了真菌葡聚糖酶對口腔鏈球菌生物膜中變聚糖的 影響，結(jié)果表明變聚糖酶與右旋糖巧酶可W有效地預(yù)防牙菌斑生物膜的形成，尤其是兩種 酶聯(lián)用時作用效果更好。2010年，Yano等人研究發(fā)現(xiàn)右旋糖巧酶與香茹多糖共同存在時抑 制生物膜形成的能力增強(qiáng)且對已形成的生物膜也具有降解作用，單獨(dú)使用右旋糖巧酶時則 對已形成的生物膜的作用效果甚微。近年來還出現(xiàn)了各種通過基因工程手段治療牙菌斑生 物膜的研究，例如將編碼右旋糖巧酶的基因在口腔細(xì)菌中克隆表達(dá)。目前丹麥Novo公司、 美國Miles公司已有商品右旋糖巧酶制品出售。Novo公司右旋糖巧酶的生產(chǎn)主要由青霉屬 發(fā)酵獲得，美國Miles公司生產(chǎn)的右旋糖巧酶則主要通過毛殼菌屬發(fā)酵生產(chǎn)獲得。運(yùn)些酶 主要應(yīng)用于制糖工業(yè)。運(yùn)兩種微生物來源的右旋糖巧酶尚未被美國食品藥物管理局批準(zhǔn)認(rèn) 可用于食品行業(yè)。為了預(yù)防牙菌斑生物膜的形成，目前國外已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種含右旋糖巧酶 的口腔護(hù)理產(chǎn)品。2001年，Song等人對斯氏油脂酵母Lipomycesstarke}d突變株KSM22 右旋糖巧酶漱口液進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與使用含0. 12%洗必泰漱口液的實(shí)驗(yàn)組相 tk，Lipomycesstark巧i突變株KSM22右旋糖巧酶漱口液在牙菌斑及牙銀炎的防治方面 效果要好，而且引起的副作用較小。2004年Masaru等人再次證實(shí)了右旋糖巧酶漱口液可W 有效地預(yù)防牙菌斑生物膜的形成，而且長期使用后效果會越來越好。
[0004] 目前國內(nèi)關(guān)于右旋糖巧酶在牙菌斑生物膜防治中的應(yīng)用的報(bào)道并不多見，而且相 對集中。1988年中國科學(xué)院微生物研究所孫晉武等人證明了淡紫擬青霉右旋糖巧酶可W抑 制變異鏈球菌產(chǎn)生胞外多糖，降低形成牙菌斑的可能性。此后北京口腔醫(yī)院趙寶榮等人通 過動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了淡紫擬青霉右旋糖巧酶對牙菌斑的抑制作用。2007年四 川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院蔣丹研究了美國Sigma公司青霉屬右旋糖巧酶對變異鏈球菌單菌 種生物膜的作用效果，結(jié)果顯示右旋糖巧酶能降解變異鏈球菌生物膜中的胞外多糖。 陽〇化]盡管國內(nèi)已出現(xiàn)關(guān)于右旋糖巧酶的部分防離報(bào)道，但尚未出現(xiàn)含右旋糖巧酶的口 腔護(hù)理產(chǎn)品。究其原因主要包括右旋糖巧酶的微生物來源及右旋糖巧酶的酶學(xué)特性。右旋 糖巧酶的產(chǎn)生菌主要為霉菌，用霉菌來生產(chǎn)預(yù)防口腔牙菌斑的右旋糖巧酶存在一定的安全 性問題，且產(chǎn)酶時間長，如果用在牙膏中，還存在堿性條件下不穩(wěn)定的問題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于擴(kuò)展口腔護(hù)理微生物的種類，特別是開發(fā)安全性能 高的海洋芽抱桿菌在口腔護(hù)理中的應(yīng)用，W改善現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
[0007]為此，本發(fā)明提供一種海洋芽抱桿菌度acillusSP.)，所述菌株為kl，保藏單位： 武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏日期：2015年7月9日，保藏號：CCTCCM2015437。
[0008] 所述菌株的16SrDNA基因序列為沈QIDNo. 2。
[0009] 本發(fā)明另一方面提供了一種海洋芽抱桿菌的菌株分離方法，包括下述步驟：
[0010] 于溫度為20~30°C的條件下，將勸海沉積物在固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)1~2天后分 離得到，其中，所述述固體培養(yǎng)基的質(zhì)量組分如下： 1] 屯、腦粉0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份、瓊脂1. 0~1. 5份，人工海水100份， 抑為7. 5~8. 0。
[0012] 本發(fā)明再一方面提供了一種海洋右旋糖巧酶的制備方法，包括下述步驟：
[0013] 將所述海洋芽抱桿菌的菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在20~3(TC的條件下振蕩 培養(yǎng)24~36小時，獲得種子培養(yǎng)液，其中，所述液體種子培養(yǎng)基的質(zhì)量組分如下：屯、腦粉 0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份，滅菌天然海水100份，抑為7. 5~8. 0;
[0014] 按體積比為1~5%將步驟所述種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，離 屯、取上清，制得發(fā)酵液，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量組分如下：屯、腦粉0.8~1.2份，蛋白 腺0. 1~0. 5份，化Cl0. 1~0. 2份，胞2冊〇4 0. 05~0. 1份，滅菌天然海水100份，抑為 8. 0 ;
[0015] 將所述發(fā)酵液過濾膜，濾液經(jīng)冷凍干燥后制得海洋右旋糖巧酶。
[0016] 在一些實(shí)施例中，在完成上述步驟后，還包括將所述海洋右旋糖巧酶進(jìn)行分離純 化的步驟。
[0017] 在一些實(shí)施例中，所述屯、腦粉是由牛屯、腦經(jīng)過脫脂、凍干、研磨、過篩后得到。
[0018] 在一些實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20~30°C，時間為26~30h。
[0019] 在一些實(shí)施例中，所述分離純化溫度為4~6°C。
[0020] 此外，本發(fā)明還提供了的上述海洋右旋糖巧酶的用途，所述海洋右旋糖巧酶在口 腔護(hù)理、日化上的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的提供了一種海洋芽抱桿菌，將其應(yīng)用于口腔護(hù)理、日化、海洋生物醫(yī)療 中，拓展了生物醫(yī)療微生物的范圍。本發(fā)明應(yīng)用于上述海洋芽抱桿菌制備得到海洋右旋糖 巧酶，對變異鏈球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可W應(yīng)用于離齒防治及在醫(yī)療，日 化等方面W外，對海洋生物醫(yī)藥等方面也具有巨大的應(yīng)用潛力。 【【附圖說明】】
[0022] 圖1為右旋糖巧酶產(chǎn)生菌株周圍的藍(lán)色透明圈；
[0023] 圖2為發(fā)酵溫度與海洋胞外右旋糖巧酶酶活的關(guān)系圖；
[0024] 圖3為發(fā)酵時間與海洋胞外右旋糖巧酶酶活的關(guān)系圖；
[00巧]圖4為最適發(fā)酵條件下細(xì)菌的生長曲線（A)與產(chǎn)酶曲線度）圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[00%] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施 例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而 非限定本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明提供一種海洋芽抱桿菌度acillusSP.)，所述菌株為kl，保藏單位：武漢 大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏日期：2015年7月9日，保藏號：CCTCCM2015437。
[0028] 經(jīng)測定，所述芽抱桿菌的菌株16SrDNA基因序列為SEQIDNo. 2,經(jīng)檢索，在 Genebank數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)完全相同的序列。
[0029] 由于篩選的微生物為芽抱桿菌，已經(jīng)作為口腔護(hù)理產(chǎn)品來源菌株，芽抱桿菌已在 化妝品生產(chǎn)名錄內(nèi)，無需再做額外檢測。
[0030] 本發(fā)明