一種cd3ak細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] CD3AK細(xì)胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指淋己 細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)抗CD3單克隆抗體（CD3McAb)激活后的殺傷細(xì)胞，在激活后，無(wú)需 CD3McAb持續(xù)存在，小劑量外源性的IL-2就可W維持其活性增殖，是WCD3+CD8叮為主的異 質(zhì)性細(xì)胞群，其前體細(xì)胞來(lái)源豐富，主要是T細(xì)胞，W其存活時(shí)間長(zhǎng)，較低的IL-2依賴性。
[0003]CD3AK細(xì)胞具有廣譜殺瘤活性，其殺傷腫瘤細(xì)胞是W其偽足和突起與祀細(xì)胞緊密 結(jié)合，祀細(xì)胞的死亡形式是調(diào)亡和溶解壞死，其抗瘤作用優(yōu)于LAK細(xì)胞，成為繼LAK和TIL 之后，腫瘤AIT研究中最受關(guān)注的腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。CD3AK細(xì)胞具有比LAK細(xì)胞和TIL更強(qiáng) 的擴(kuò)增及抗腫瘤能力，體外抗腫瘤能力比常規(guī)LAK高6~20倍，對(duì)NK細(xì)胞敏感和LAK細(xì)胞 敏感的腫瘤細(xì)胞均有不同程度的殺傷效應(yīng)。能夠有選擇地直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，但對(duì) 自體或異體轉(zhuǎn)化的淋己細(xì)胞和正常組織細(xì)胞沒(méi)有殺傷活性，對(duì)人體沒(méi)有毒副作用。CD3AK 細(xì)胞能夠第一時(shí)間糾正患者的免疫功能，提高腫瘤患者對(duì)手術(shù)、放療和化療的耐受，并且可 W消滅殘存腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)，預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)有重要的意義，所W CD3AK細(xì)胞在腫瘤治療方面有著重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。
[0004]目前，對(duì)于CD3AK細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)主要是采用廝血分離淋己細(xì)胞，經(jīng)CD3McAb和 IL-2誘導(dǎo)CD3AK細(xì)胞，加入胎牛血清。但該方法存在一定的缺陷，如雖然細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量較 大，但是細(xì)胞的殺傷活性較低。因此，急需提供一種既能大量擴(kuò)增CD3AK細(xì)胞的數(shù)量，又能 提高細(xì)胞的殺傷活性的CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法。該CD3AK細(xì) 胞培養(yǎng)組合物可促進(jìn)CD3AK細(xì)胞的增殖，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活力。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物，包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、 漢黃琴素、血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0008] 本發(fā)明將CDMcAb、比-2、IL-15、田屯皂巧、漢黃琴素、血清添加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng) CD3AK細(xì)胞，可促進(jìn)CD3AK細(xì)胞的增殖，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活力，且CD3AK細(xì)胞的純度較 局。
[0009] 作為優(yōu)選，組合物中各組分用量為：
[0010] CDMcAb IO~-50 H gZmL lL-2 100~300U/mL 山-15 10、'30U/mL 田七皂普 10~50mg/mL 漢黃萃素 0.2~6mg/L 血清 2%-^0%體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0011] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0012] CDMcAb 10 UgZmL IL-2 lOOU/iriL 比巧 lOU/mL 田七皂每 lOmg/mL 漢黃茶素 0.2mg/L 血清 2〇/。體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0013] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0014] CDMcAb 50 U g/mL 1L-2 300U/niL
[0015] 圧-15 30U/niL 田毛皂魯 50nig/niL 漢黃茶素 6mg/L 血證 20%體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0016] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0017] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL 化.-15 20U/inL 巧七皂皆 SOrngZmL 漢黃零素 3mg/L 血清 10%體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0018] 作為優(yōu)選，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0019] 作為優(yōu)選，血清為自體血清。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0021] 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將PBMC重懸，加入CDMcAb、比-2、比-15、田屯皂巧、漢黃琴素和血 清，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每隔3天補(bǔ)液一次，獲得CD3AK細(xì)胞。
[0022] 作為優(yōu)選，本發(fā)明CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)方法中各組分用量為：
[0023] CDMcAb KK50 |i g/rriL 比-2 100--300U/mL IL-15 10~30U/mL 田七皂普 KK50mg/mL 漢黃茶素 0.2~6mg/L 血清 2%~20%體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0024] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[00巧] CDMcAb lOlig/rnL 1L-2 lOOU/mL 山-15 lOU/mL
[0026] 巧毛皂普 1 Omg/mL 漢黃茶素 0.2mg/L 血清 2〇/〇體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0027] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[0028] CDMcAb 50 U g/inL IL-2 300U/mL ILl 5 30UAiiL 田"t:皂普 SOmgZmL 漢黃茶素 6mg/L 血清 20%體積分?jǐn)?shù) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0029] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[0030] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL IL-15 20U/mL 田七皂普 30mg/mL 漢黃茶素 3mg/L 血簿 ！0%體轉(zhuǎn)分獄， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 余量。
[0031] 作為優(yōu)選，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0032] 作為優(yōu)選，血清為自體血清。
[0033] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)的條件為37°C、濃度為5%的0)2。
[0034] 作為優(yōu)選，PBMC的接種密度為（1~10)XIO6個(gè)/mL。
[003引在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，PBMC的接種密度為1XIO6個(gè)/mL。
[0036] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，補(bǔ)液為：補(bǔ)加基礎(chǔ)培養(yǎng)基、CDMcAb、比-2、IL-15、田 屯皂巧、漢黃琴素，CDMcAb終濃度為10~50yg/mL，IL-2終濃度為100~300U/mL，比-15 終濃度為10~30U/血，田屯皂巧終濃度為10~50mg/mU漢黃琴素終濃度為0. 2~6.Omg/ L補(bǔ)液后細(xì)胞密度在（0. 5~1. 0)XIO6個(gè)/mL。
[0037] 作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)為7~10天。
[0038] 本發(fā)明提供了一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法。該CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合 物包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、漢黃琴素、血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如 下優(yōu)勢(shì)之一：
[0039] 1、本發(fā)明CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物可促進(jìn)CD3AK細(xì)胞的大量增殖，并且提高其細(xì)胞 的殺傷活性；
[0040] 2、本發(fā)明采用自體血清來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；
[0041] 3、本發(fā)明只需較低劑量的IL-2,大大降低了生產(chǎn)成本；
[0042] 4、本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來(lái)的CD3AK細(xì)胞純度較高。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1是本發(fā)明培養(yǎng)方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的CD3AK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明公開了一種CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借 鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò) 較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述 的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[004引術(shù)語(yǔ)解釋：
[0046]CDMcAb:CD3AK細(xì)胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指 淋己細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)抗CD3單克隆抗體（CD3McAb)激活后的殺傷細(xì)胞，在激活后，無(wú)需 CD3McAb持續(xù)存在，小劑量外源性的IL-2就可W維持其活性增殖，是WCD3+CD8+T為主的異 質(zhì)性細(xì)胞群，其前體細(xì)胞來(lái)源豐富，主要是T細(xì)胞，W其存活時(shí)間長(zhǎng)，較低的IL-2依賴性。
[0047] 比-2 :即白細(xì)胞介素-2(interle址in-2,比-2)，又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子燈cell growthfactor,TCRF)。主要由活化的CD4+Thl細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子。 可促進(jìn)ThO和CTL的增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān) 視。環(huán)抱素、他克莫司等免疫抑制劑可W抑制其活性和生成。
[0048] 比-15:即白細(xì)胞介素-15(interle址in-15,比-15)，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，生物學(xué)作 用與IL-2相似。其細(xì)胞來(lái)源和祀細(xì)胞分布較IL-2廣，故可能在不表達(dá)IL-2的部位發(fā)揮類 似IL-2的效應(yīng)。
[0049] 田屯皂巧：是從S屯提取的S屯皂巧，包括人參皂巧化1、人參皂巧RgUS屯皂巧 Rl等，能增加腦血管流量，擴(kuò)張腦血管，改善血流動(dòng)力學(xué)，降低腦缺血。
[0050] 漢黃琴素：又名5, 7-二徑基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并巧喃-4-酬，是一 種溶于有機(jī)溶劑而不溶于水的黃色針狀結(jié)晶物。用小鼠切除的小腸實(shí)驗(yàn)表明有磐粟堿樣的 解疫作用，但作用較弱，約為磐粟堿的五分之一。大鼠口服可降低乙醇所致的甘油=酸醋水 平。還具有抗癌作用、利尿作用。
[0051]外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):即外周血中具 有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋己細(xì)胞和單核細(xì)胞。
[0052]本發(fā)明提供的CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法中所用CDMcAb、細(xì)胞因子、培 養(yǎng)基、中藥成分均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0053] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0054] 實(shí)施例1CD3AK細(xì)胞的培養(yǎng) [00巧]1、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離
[005引采集50~1