例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 實(shí)施例1 :本發(fā)明所述新型分子量內(nèi)標(biāo)的制備方法
[0029] 本發(fā)明的分子量內(nèi)標(biāo)可W通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或酶切法制備，W下分別就 運(yùn)兩種方法進(jìn)行詳細(xì)闡述，W使本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要創(chuàng)造性勞動就能實(shí)施。
[0030] UPCR方法制備：
[0031] 1. 1設(shè)計(jì)并合成上下游引物
[0032] 通過一個廣泛使用的外源DNA模板。用PrimerExpress軟件分析外源DNA全序 列，在上游巧'）設(shè)計(jì)引物，并在引物的5'用N冊35進(jìn)行標(biāo)記。上游引物5'-GCCCGTCGAGAAT ACTGGCAATTTCACCTGC-3'，退火溫度58°C。W上游引物為起點(diǎn)，在其下游相應(yīng)距離找下游引 物的終點(diǎn)，下游引物的長度和序列要保證有較好的特異性同時退火溫度跟上游引物接近， GC含量在20-40%之間，沒有復(fù)雜二級結(jié)果，與上游引物不能形成二聚體。
[0033] 1.2PCR擴(kuò)增
[0034] 合成上游引物及下游引物后，將引物用TE稀釋至lOpM，摸索擴(kuò)增反應(yīng)條件，用該 條件擴(kuò)增得到產(chǎn)物并檢測，擴(kuò)增反應(yīng)在AB9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
[0035] 最終反應(yīng)體系如表1，反應(yīng)條件如下：
[003引表1反應(yīng)體系
[0039] 反應(yīng)條件是：95°CIlmin;30cycles: 94°C30sec，59°C60sec，68°C60sec;60°C 60min〇
[0040] I. 3調(diào)整產(chǎn)物量，使各個條帶峰值均衡
[0041] 上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得的目的片段，經(jīng)過毛細(xì)管電泳檢測各目的片段大小 是否正確，檢測正確之后，分析目的片段峰面積，并通過計(jì)算將各目的片段混合配平，直到 所有目的片段的峰高之間相差小于或等于10%。
[004引通過調(diào)整各個條帶的含量使其達(dá)到等摩爾比例，峰值比較均一，ABI3130遺傳分析 儀進(jìn)行檢測。檢測方法如下：
[0043] 1)取0. 5yL與9. 5yL甲酯胺混合，95C變性3分鐘，立即置于冰上；
[0044] 2)ABI3130遺傳分析儀檢測：參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣電壓1千伏，進(jìn)樣時間15秒，電泳電 壓15千伏，電泳時間1400秒；
[0045] 3)各片段峰高大于500RRJ。
[004引實(shí)施例2 :STR分型檢測
[0047] 按照實(shí)施例1所述的方法制備的分子量內(nèi)標(biāo)，由分子量為75、76、80、100、140、 160、161、175、180、200、225、226、250、275、300、330、331、360、390、445、500、5(nbp的片段構(gòu) 成。
[0048] 當(dāng)Buffer槽中的Buffer、水槽中的水、毛細(xì)管W及POP膠和甲酯胺中某一部分出 現(xiàn)過期或不合格時，使用本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行STR分型檢測，結(jié)果如圖1所示。
[0049] 圖1結(jié)果顯示本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)可W區(qū)分160bp和16化p、225bp和22化P的 單堿基差異，保證單個堿基分辨率；而LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)無法區(qū)分160bp和16化P，也無 法分開225bp和22化P，無法分辨單個堿基，不能保證基因分型。。
[0050] 分別使用本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)和Liz-500分子量內(nèi)標(biāo)對相鄰的兩片段中有片 段并不在Bin上的基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2和圖3所示。
[0051] 圖2和圖3結(jié)果顯示Liz-500分子量內(nèi)標(biāo)無法確定不在Bin上的片段是否是產(chǎn)物 峰，而本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)可W判斷不在Bin上的片段是否是正確的產(chǎn)物峰。
[0052] 進(jìn)一步使用本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)在測序儀上檢測分型，結(jié)果如圖4-6所示。
[0053] 圖4-6結(jié)果顯示本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)在測序儀上檢測能夠清楚區(qū)分75bp和 76bp，160bp和 16化P，225bp和 226bp，330bp和 33化P，500bp和 5(Ubp，表明本發(fā)明所述分 子量內(nèi)標(biāo)在分析區(qū)域內(nèi)，具有單堿基分辨的能力，可W有效地區(qū)分相差一個堿基的PCR產(chǎn) 物片段，方便人員判讀。
[0054] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分子量內(nèi)標(biāo)，由η條不同分子量的帶有可識別的標(biāo)記物的核苷酸片段構(gòu)成；其 中至少包含Ρ對相差一個堿基的核苷酸片段對；所述相差一個堿基的核苷酸片段對中一個 片段的堿基數(shù)為m，另一個片段的堿基數(shù)為m+1或m-1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子量內(nèi)標(biāo)，η為偶數(shù)時，ρ為1~n/2 ;n為奇數(shù)時，ρ為1~ (n-l)/2〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子量內(nèi)標(biāo)，ρ為2~6。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的分子量內(nèi)標(biāo)，30〈m〈5000,優(yōu)選為30〈m〈1000。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的分子量內(nèi)標(biāo)，30〈m〈600。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的分子量內(nèi)標(biāo)，所述可識別的標(biāo)記物為熒光標(biāo)記 物，其熒光發(fā)射區(qū)域在400nm~lOOOnm范圍內(nèi)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子量內(nèi)標(biāo)，所述熒光標(biāo)記物為LIZ、FAM、HEX、JOE、TMR、TET、 VIC、NH635或Cy5。8. 權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分子量內(nèi)標(biāo)在片段分析中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述片段分析為STR分型、測序、大片段分析以及基因 組分析。10. -種包括權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分子量內(nèi)標(biāo)的片段分析試劑 盒。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種分子量內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)，由n條不同分子量的帶有可識別的標(biāo)記物的核苷酸片段構(gòu)成；其中至少包含p對相差一個堿基的核苷酸片段對；所述相差一個堿基的核苷酸片段對中一個片段的堿基數(shù)為m，另一個片段的堿基數(shù)為m+1或m-1。本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)相對現(xiàn)有的商業(yè)分子量內(nèi)標(biāo)而言，具有分辨單個堿基的能力，可以有效地區(qū)分相差一個堿基的PCR產(chǎn)物片段，能確保正確分型，從而方便檢測人員判讀，廣泛適用于STR分型，測序，大片段分析以及基因組分析。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105296473
【申請?zhí)枴緾N201510535029
【發(fā)明人】畢萬里, 陸偉華
【申請人】蘇州新海生物科技股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年8月27日