水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛源性成分鑒定中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動(dòng)物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛 源性成分鑒定中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人民生活水平的提高，肉品消費(fèi)量的增加，市場上也出現(xiàn)了各種肉制品滲假 的現(xiàn)象。在肉品的進(jìn)出口貿(mào)易中，由于我國對肉品質(zhì)質(zhì)量的檢驗(yàn)方法較為落后，錯(cuò)檢、漏檢 現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。W次充好，滲雜滲假嚴(yán)重影響了公平交易、食品安全，甚至設(shè)及到宗教信仰 問題。因此肉制品來源的安全性成為消費(fèi)者關(guān)屯、的焦點(diǎn)問題之一，而對肉制品的來源進(jìn)行 鑒定并建立便捷的檢測方法是解決運(yùn)一問題的關(guān)鍵。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中對于肉源食品的鑒定主要包括蛋白質(zhì)分析法，例如電泳法、免疫法等 技術(shù)，運(yùn)對于生肉的鑒別具有一定可行性，但特異性差、準(zhǔn)確率低。國內(nèi)已發(fā)表的針對水牛 屬特異性的檢測方法，是通過大量的測序工作和比對分析，獲得屬間物種特異性基因位點(diǎn)， 由此設(shè)計(jì)特異性引物并用于物種鑒別。然而針對該目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的特異性引物僅可用于水 牛、黃牛與巧牛的鑒別，而對其他物種是否也適用并未做研究。因此，如何有效、準(zhǔn)確地判別 出肉制品是否屬于水牛肉，并建立一種簡單易行的檢測方法具有緊迫性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可用于水牛源性制品特異性檢測 的引物；
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供用于水牛源性制品檢測的檢測試劑盒；
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供水牛源性成分的鑒定方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從種內(nèi)一致性和穩(wěn)定性、種間特異性、拷貝數(shù)等方面進(jìn)行 水?；蚪M特異DNA序列的篩選，經(jīng)過普通牛、羊（綿羊、山羊）、豬、馬、驢、鼠（大鼠、小鼠、 倉鼠）、豚鼠、雞、鴨、碟、兔、狗、狐、水貂和駱子的基因組DNA及不同的水牛品種DNA中的檢 ，篩選在水牛中特異的、在其他物種中不存在或同源性低的DNA片段作為檢測分子。經(jīng)過 大量分析和實(shí)驗(yàn)工作，最終獲得可供檢測使用的特異DNA序列，其核巧酸序列如序列表SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 基于此，本發(fā)明首先提供一種水牛特異性引物，其能特異性擴(kuò)增SEQIDNo. 1所示 的核巧酸序列或該序列的特異性片段。
[0009] 優(yōu)選地，引物長度為18~27bp。引物的設(shè)計(jì)需要考慮是否容易發(fā)生錯(cuò)配、擴(kuò)增片 段長度、反應(yīng)溫度等多方面。
[0010] 優(yōu)選地，該引物序列如下：
[0011] SUBALUS-F: 5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3,
[0012] BUBALUS-R:5' -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3';
[0013] 或該引物向5'、3'端延伸或修飾得到的仍能特異性擴(kuò)增SEQIDNo.I所示序列 的引物。
[0014] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供含有上述特異性引物的檢測試劑盒。
[001引優(yōu)選地，所述試劑盒還包括下述試劑中的一種或多種：Taq酶、dNTPs、MgClz、PCR緩沖液、陽性對照DNA模板、雙蒸水；或者還包括下述試劑中的一種或多種：TaqDNA MasterMix、陽性對照DNA模板、雙蒸水。
[0016] 所述陽性對照DNA模板為牛科水牛屬的水?；蚪MDNA模板；
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供上述的水牛特異性引物或檢測試劑盒在水牛源性成分鑒定中 的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛源性成分鑒定中的PCR檢測方 法，其步驟如下所述：
[0019] 1)提取樣品基因組DNA;
[0020] 2)用上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并W水牛DNA模板為陽性對照，W雙蒸水為空白對 照；
[0021] 3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判定。
[002引優(yōu)選地，其中步驟2)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1 [0023]表1本發(fā)明PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系
[002引PCR反應(yīng)程序如下：
[0026] 94°C預(yù)變性 5min;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 133,30次循環(huán)；4°(：降溫 2min〇
[0027] 結(jié)果判定方法是：當(dāng)PCR反應(yīng)產(chǎn)物與陽性對照擴(kuò)增產(chǎn)物相符，且空白對照無擴(kuò)增 產(chǎn)物時(shí)，判定樣品中檢測出水牛源性成分；當(dāng)PCR反應(yīng)產(chǎn)物無擴(kuò)增產(chǎn)物或與陽性對照擴(kuò)增 產(chǎn)物不符，且空白對照無擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，判定樣品中未檢測出水牛源性成分；如果陽性樣品未 檢測出預(yù)期片段，說明試劑失效或操作失誤；若空白對照與陽性樣品均檢出，說明試劑污染 或操作失誤。
[0028] 本發(fā)明中檢測結(jié)果可用瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)，也可用測序或其他有效方法檢測； 提取樣品DNA的方法可用苯酪-氯仿提取法，也可使用公認(rèn)的、具有相同效力的其他提取方 法。
[0029] 本發(fā)明提供了有效的、精準(zhǔn)的、可靠的水牛源性成分分子鑒定方法，所組裝的試劑 盒能快速鑒定樣品中是否含有水牛源性成分。本發(fā)明的方法可W在肉品、飼料和皮張檢測 中作為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法使用。本發(fā)明試劑盒及檢測方法具有簡便、快速、全面、特異性強(qiáng)的特 點(diǎn)，且成本較低，適用性廣。
【附圖說明】
[0030] 圖1是SEQIDNO. 1核巧酸特異序列在水牛中具有物種特異性的檢測結(jié)果。W牛 科水牛屬的水牛、?？品撬賱?dòng)物（普通牛、綿羊、山羊）和非?？撇溉閯?dòng)物（小鼠、大 鼠、倉鼠、豚鼠、豬、馬、驢、兔、狐、狗、水貂、駱子）W及非哺乳動(dòng)物（雞、鴨、碟）的基因組 DNA為模板，擴(kuò)增SEQIDNo. 1所示的特異片段，所有測試樣品中僅在水牛中得到擴(kuò)增產(chǎn)物， 非水牛物種中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明所擴(kuò)增片段在水牛中具有特異性。泳道中編號(hào)說明 如下：M:為DL2000P1USDNAMarker;1-3 :空白對照；4-6 :水牛；7-9 :小鼠；10-12 :大鼠； 13-15 :倉鼠；16-18 :豚鼠；19-21 :普通牛；22-24 :綿羊；25-27 :山羊；28-30 :豬；31-33 : 馬；34-36 :驢；37-39 :雞；40-42 :鴨；43-45 :碟；46-48 :兔；49-51 :狐；52-54 :狗；55-57 : 水貂；58-60 :駱子。
[0031] 圖2:是SEQIDNO. 1核巧酸特異序列在水牛不同DNA模板濃度中的靈敏度檢測結(jié) 果。分別Wo.Ing/yLlng/yUlOng/yLIOOng/yL的水牛DNA為模板，擴(kuò)增沈QIDNO. 1 核巧酸特異片段，Ing/yL的模板濃度即有擴(kuò)增，表明特異性引物所擴(kuò)增片段具有較好的靈 敏性。泳道中編號(hào)說明如下：M:為DL2000P1USDNAMarker;l-4:空白對照；5-8:0.Ing/ yL的模板濃度；9-12 :Ing/yL的模板濃度；13-16 :IOng/yL的模板濃度；17-20 :IOOng/ yL的模板濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0032]W下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制，在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所做的修改或潤色均屬于本發(fā)明的范圍。
[0033] 實(shí)施例1樣品中水牛源性成分特異性檢測
[0034] 1.試樣的制備與保存
[0035] 1. 1 取樣
[0036] 采集水牛肉樣品Ig,于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 1.2DNA模板制備
[0038]DNA模板制備采用常用的苯酪-氯仿粗提法（薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂 斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.金冬雁，黎孟楓.北京：科學(xué)出版社，1999. 465-467) 或者公認(rèn)的、具有相同效力的其他提取方法，運(yùn)些方法都是報(bào)道的常用方法。
[0039] 2.引物設(shè)計(jì)
[0040] 本實(shí)施例的引物序列如表2和序列表SEQIDNO:2和3所示。
[00川表2本發(fā)明設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物
[0043]
[0044] 預(yù)期擴(kuò)增片段大小為23化p，其核巧酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
[0045] 實(shí)驗(yàn)表明，該引物特異性強(qiáng)，在水牛各品種中均能有效擴(kuò)增，而在其他18個(gè)非水 牛物種中都無目的片段擴(kuò)增；且引物的靈敏度較高，在模板DNA濃度為Ing/uL時(shí)即可擴(kuò)增。 W上述引物分別向3'、5'延伸一個(gè)堿基和兩個(gè)堿基或修飾形成的引物對進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn) 表明仍能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，