一種海洋酯酶及其編碼基因e22與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種海洋醋酶及其編碼基因E22與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 醋酶（esterase)，又稱簇酸醋酶，是具有重要工業(yè)價(jià)值的生物催化劑之一，可W水 解醋類底物產(chǎn)生酸類和醇類物質(zhì)，也可W催化逆反應(yīng)合成各種醋類。其通常作用于簡(jiǎn)單的 醋類或低于10個(gè)碳原子的短鏈甘油醋。醋酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。相較于動(dòng) 植物來(lái)源的醋酶，微生物來(lái)源的醋酶不僅種類多、來(lái)源廣、作用高效，而且具有便于工業(yè)化 生產(chǎn)、易純化及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，微生物醋酶在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用最多。醋酶催化 的反應(yīng)具有較高的底物專一性、區(qū)域選擇性和對(duì)映選擇性，是合成手性藥物、農(nóng)藥、化妝品 及精細(xì)化工品等手性化合物的高效生物催化劑，微生物醋酶在有機(jī)化學(xué)合成中的應(yīng)用已成 為研究的熱點(diǎn)。
[0003] 在藥物生產(chǎn)中，主要應(yīng)用醋酶從外消旋混合物中合成高純的單一手性藥物，運(yùn)在 提高藥效的同時(shí)也極大地降低了副作用。通過(guò)醋酶合成的醇類、氨基類、簇酸類和醋類等手 性分子，已被用于癌癥、病毒感染、高脂血癥、抑郁癥及老年癡呆等疾病的治療中。相較于化 學(xué)合成，微生物酶制劑在手性化合物的合成中具有很多先天優(yōu)勢(shì)，包括反應(yīng)條件溫和（常 溫、常壓）、設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)安全、反應(yīng)速率快、反應(yīng)步驟少、副反應(yīng)少、收率高、產(chǎn)品光學(xué)純度 高W及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前手性藥物制備領(lǐng)域的新興研究熱點(diǎn)。
[0004] 海洋約占地球表面積的71%，是一個(gè)開(kāi)放、多變、復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。海洋環(huán)境中物 理、化學(xué)因素的特殊性和復(fù)雜性，造就了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態(tài)功能上的 多樣性。海洋來(lái)源的醋酶通常具有與海洋環(huán)境相關(guān)的優(yōu)良性質(zhì)，包括溫度穩(wěn)定性、耐鹽性、 耐堿性、耐低溫、W及優(yōu)異的手性選擇性等，因此，從海洋微生物中篩選出性質(zhì)獨(dú)特的具有 工業(yè)潛力的新型醋酶就成了開(kāi)發(fā)新型工業(yè)酶制劑的一個(gè)重要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海洋醋酶及其編碼基因E22與應(yīng)用。
[0006] 一種海洋醋酶基因E22,核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 上述基因編碼的海洋醋酶E22,氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 一種重組表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有如SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的功能片 斷。
[0009] 一種重組細(xì)胞，該宿主菌包含有上述重組表達(dá)載體或表達(dá)上述海洋醋酶E22。
[0010] 上述海洋醋酶E22和/或上述海洋醋酶基因E22在手性化合物合成中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明海洋醋酶的基因E22來(lái)自大西洋位點(diǎn)TVG05和TVG07的混合海底表層沉 積物宏基因組文庫(kù)中大腸桿菌EPI300克隆子E22-3的大片段質(zhì)粒化smidDNA。通過(guò)構(gòu)建 E22-3克隆子中化smid的亞克隆文庫(kù)和后期測(cè)序，確定了該克隆子化smid上攜帶的醋酶基 因E22的核酸序列。根據(jù)E22基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR技術(shù)從E22-3克隆子的 化smidDM克隆了編碼海洋醋酶E22的基因，構(gòu)建了含海洋醋酶基因E22的表達(dá)載體化及 含有該表達(dá)載體的大腸桿菌重組細(xì)胞。
[0012] 測(cè)序結(jié)果表明醋酶基因E22為一個(gè)含有1，437個(gè)核巧酸的開(kāi)放閱讀框架，該開(kāi)放 閱讀框架共編碼478個(gè)氨基酸的前體蛋白。N端測(cè)序及MAUHT0FMS分析表明，成熟有活性 的醋酶E22序列中缺少前體蛋白中N端1-102個(gè)氨基酸，因此，成熟有活性的醋酶E22是一 個(gè)含有376個(gè)氨基酸的多膚。對(duì)多種手性醋底物的活性分析表明，醋酶E22能選擇性降解 2, 3-0-異亞丙基甘油酸甲醋的對(duì)映異構(gòu)體，其只能降解S構(gòu)型的底物并生成S構(gòu)型甘油醒 縮丙酬的前體。S構(gòu)型的甘油醒縮丙酬是一類重要的手性合成中間體和化工原料，已被廣泛 用于手性藥物、化學(xué)品和天然產(chǎn)物的全合成中，因此，海洋醋酶E22具有合成重要手性化合 物的工業(yè)應(yīng)用潛力。
[0013] 有益效果
[0014] 1、本發(fā)明所述的海洋醋酶E22能高效選擇性地降解手性醋，具有合成重要手性化 合物的工業(yè)應(yīng)用潛力。
[0015] 2、本發(fā)明所述的海洋醋酶E22在常溫下有較高酶活性，中高溫下極不穩(wěn)定，中溫 就可W使其完全失活，從而保證了其使用的安全性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1、通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆的編碼醋酶E22的基因片段的電泳結(jié)果照片；
[0017] 其中：1、擴(kuò)增的DNA片段，M、DNA分子量標(biāo)記（marker);
[0018] 圖2、在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)和純化的醋酶E22電泳結(jié)果照片；
[0019] 其中：1、經(jīng)過(guò)儀柱親和層析純化后的純醋酶E22電泳圖，M、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記 (marker)；
[0020] 圖3、醋酶E22的降解底物活性分析柱狀圖；
[0021] 圖4、醋酶E22的酶活溫度曲線圖；
[0022] 其中：(A)溫度對(duì)酶活性的影響曲線圖，度）溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響曲線圖； 陽(yáng)02引 圖5、醋酶E22的酶活抑曲線圖；
[0024] 其中：(A)PH對(duì)酶活性的影響曲線圖，度)抑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0026] 培養(yǎng)基：
[0027] LB液體培養(yǎng)基：lwt%蛋白腺，0. 5wt%酵母粉，Iwt%化Cl,蒸饋水配制。
[0028] LB固體平板：lwt%蛋白腺，0. 5wt%酵母粉，Iwt%化〔1，1. 5wt%瓊脂，蒸饋水配 制。
[0029] 實(shí)施例1 :海洋醋酶E22編碼基因序列的獲取及其序列分析
[0030] 菌種來(lái)源：大西洋位點(diǎn)TVG05和TVG07的混合海底沉積物宏基因組文庫(kù)中大腸桿 菌EPI300克隆子E22-3。
[0031] 具體步驟如下：
[0032] 1. 1亞克隆文庫(kù)的構(gòu)建
[0033] 用OMEGA公司的BAC/PACDNA提取試劑盒按照其說(shuō)明提取大腸桿菌EPI300克隆子 E22-3中的大片段質(zhì)?；痵mid。然后用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(購(gòu)自化rmentas公司）對(duì)提 取到的化smid進(jìn)行部分消化，W獲取2, 000-5, 00化P的DNA片段，將其連接到經(jīng)BamHI消 化及去憐酸化處理的PUC19質(zhì)粒（購(gòu)自肥B公司）上。連接反應(yīng)液電轉(zhuǎn)E.COliToplO感 受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100yg/ml氨節(jié)青霉素和1 % (v/v)S下酸甘油醋（購(gòu)自Sigma公司） 的LB固體平板，37°C倒置培養(yǎng)12~16h，構(gòu)建成克隆子E22-3的化smidDNA的亞克隆文 庫(kù)。
[0034] 1. 2醋類水解酶基因序列的確定
[0035] 選取固體平板上產(chǎn)生透明降解圈的亞克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。用NCBIORF Finder軟件預(yù)測(cè)DNA序列上可能的開(kāi)放閱讀框架。用BLASTX在NCBInr庫(kù)中對(duì)預(yù)測(cè)的開(kāi) 放閱讀框架進(jìn)行相似性捜索，W確定克隆子E22-3上攜帶的醋酶基因序列E22,基因E22共 1，43化P，其中含有一個(gè)1，43化P的開(kāi)放閱讀框架，其編碼海洋醋酶E22,起始密碼子位于 化P，終止密碼子位于1，43化P，共編碼478個(gè)氨基酸的前體蛋白。獲得的海洋醋酶E22編碼 基因E22的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。海洋醋酶E22前體蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。N端測(cè)序及MUHTOFMS分析表明，成熟有活性的醋酶E22序列中缺少前體 蛋白中N端1-102個(gè)氨基酸。因此，成熟有活性的海洋醋酶E22是一個(gè)含有376個(gè)氨基酸 的多膚。
[0036] 1. 3海洋醋酶E22的序列分析
[0037] GenBank中，與海洋醋酶E22最相似的序列為來(lái)源于Alteromonasmacleodii的同 絲氨酸乙酷基轉(zhuǎn)移酶（WP_039225606. 1)，序列相似性為95%。該蛋白是基于基因序列預(yù)測(cè) 的，其生化性質(zhì)尚未被研究。在已表征過(guò)的同源蛋白中，與海洋醋酶E22最相似的序列為來(lái) 源于BacillusAnt虹acis的同絲氨酸乙酷基轉(zhuǎn)移酶（3111)，序列相似性僅為38%。為了 確定海洋醋酶E22的進(jìn)化位置，發(fā)明人從NCBInr庫(kù)中下載已報(bào)道酷基轉(zhuǎn)移酶的代表序列 W及醋酶E22的同源序列。通過(guò)CLUSTALX軟件對(duì)獲得的同源序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。選 擇JTT模型，用MEGA6. 0構(gòu)建微生物來(lái)源醋類水解酶的進(jìn)化樹(shù)。在進(jìn)化樹(shù)上，海洋醋酶E22 及其同源序列與已報(bào)道的酷基轉(zhuǎn)移酶序列形成不同的分支，運(yùn)表明海洋醋酶E22所在的分 支可能是酷基轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新的亞類群，而海洋醋酶E22是該亞類群中第一個(gè)被研究 的蛋白。 陽(yáng)03引實(shí)施例2 :海洋醋酶E22的克隆、異源表達(dá)及分離純化 [0039] 2. 1利用PCR基因?qū)22序列進(jìn)行擴(kuò)增 W40] (1)根據(jù)基因E22序列設(shè)計(jì)兩條特異性引物：
[0041]22F：GGGAATTCCATATGATGAATTGGAACAAGTCG(SEQIDNO. 3)，用下劃線標(biāo)出的是 NdeI酶切位點(diǎn)；SEQIDNO. 3
[0042]22R：CCGCTCGAGTTGCATTGCTGCCTTATC(SEQIDNO. 4)，用下劃線標(biāo)出的是化〇1 酶切 位點(diǎn)；SEQIDNO. 4
[0043] 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。 柳44] 似W22F和22R為引物，W基因E22所在的fosmid為模板，用Fas巧fuDNA聚合 酶（購(gòu)自Transgen公司）擴(kuò)增目的基因片段；
[0045]PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min;然后95°C變性20sec，50°C退火20sec，72°C延 伸lmin，30個(gè)循環(huán)后；72°C延伸lOmin。
[0046] (3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Iwt%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明獲得一