一種dsRNA表達載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種dsRNA表達載體及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] RNAi是指是指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(dsRNA)所致的細胞內(nèi)同源祀基因有效的和 特異性的基因封閉。雙鏈RNA所介導(dǎo)的有效的和特異性的基因沉默已在多種無脊椎動物和 脊椎動物中發(fā)現(xiàn)和證實，例如線蟲、果觸、斑馬魚等。
[0003]RNAi-經(jīng)發(fā)現(xiàn)就成為研究的熱點，為研究基因功能、信號傳導(dǎo)通路和基因治療提 供新思路。在醫(yī)學研究中，腫瘤的RNAi治療將成為基因治療的重要部分，dsRNA新型藥劑 的開發(fā)將成為一項新興產(chǎn)業(yè)。
[0004]RNAi在昆蟲中也得到了廣泛研究?？茖W家通過dsRNA的人工導(dǎo)入，有目的地干擾 昆蟲體內(nèi)內(nèi)源基因的表達，從而根據(jù)基因缺失的擬表型確定該基因的功能。近年來，RNAi技 術(shù)在導(dǎo)入方法和基因功能分析方面都取得了迅猛發(fā)展，且與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合成功應(yīng)用于 害蟲防治領(lǐng)域。目前昆蟲RNAi導(dǎo)入方法主要有注射法、喂食法和組織培養(yǎng)法。研究發(fā)現(xiàn)， 通過飼喂表達dsRNA的作物或微生物來沉默特定基因進而控制害蟲，更有利于RNAi在害蟲 防治中的應(yīng)用，為農(nóng)業(yè)害蟲防治領(lǐng)域開辟新的空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種雙鏈RNA(dsRNA)表達載體及應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的dsRNA表達載體祀T30s，其構(gòu)建方法如下：
[0007] 1)W祀T30a為骨架載體，采用內(nèi)切酶甜al和BlpI切除載體中兩個酶切位點之間 的片段；
[000引 2)合成W下DNA片段：
[0010] 采用內(nèi)切酶甜al和BlpI進行雙酶切，替換掉祀T30a載體中的相應(yīng)片段，即構(gòu)建 得到載體祀T30S。
[0011] 該載體W祀T30a為原始載體，去除了化S-化g、凝血酶酶切位點、S-Tag和腸激酶 酶切位點等區(qū)域，增加了反向T7啟動子和T7終止子。可運用雙酶切和連接技術(shù)，將目的基 因連接到載體的表達區(qū)域，形成重組表達質(zhì)粒。
[0012] 優(yōu)選地，載體祀T30s的全序列如SeqIDNo. 1所示，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。
[0013] 該載體具有W下特征：
[0014] 1、具有卡郝霉素抗性，便于篩選陽性克??；
[0015] 2、同時具有正向和反向T7啟動子，可W雙向轉(zhuǎn)錄RNA;
[0016] 3、在正向和反向T7啟動子后面都帶有乳糖操縱子，可W更精確地雙向調(diào)節(jié)RNA的 轉(zhuǎn)錄；
[0017] 4、乳糖操縱子后即為一段多酶切位點區(qū)域，其中的酶切位點均是常見的酶切的位 點，操作方便；
[0018] 5、同時具有正向和反向T7終止子，終止多余片段的轉(zhuǎn)錄，減少了多余RNA的轉(zhuǎn)錄。
[0019] 載體祀T30S的使用方法包括W下步驟：
[0020] (1)引物設(shè)計；引物退火溫度6(TC左右；引物設(shè)計時要帶上酶切位點和保護堿基， W便后續(xù)與帶有相同酶切位點的表達載體祀T30S進行連接。目的基因CDNA序列中一定不 含該酶切位點，且上、下游引物所帶2個酶切位點在載體祀T30S上的位置要盡可能遠一點； 引物設(shè)計時選用的內(nèi)切酶應(yīng)該從載體多酶切位點區(qū)域中的酶切位點中選定；
[0021] (2)目的基因的克隆；采用高保真酶進行基因擴增，體系和程序參照酶說明書；
[0022] (3)雙酶切；用預(yù)先設(shè)計好的相應(yīng)內(nèi)切酶，對祀T30S載體和PCR擴增產(chǎn)物進行雙 酶切，反應(yīng)體系及條件參見內(nèi)切酶使用說明書。然后回收酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物回收方法參見膠回 收試劑盒說明書；
[0023] (4)連接；將雙酶切回收的目的基因產(chǎn)物與對應(yīng)的雙酶切祀T30S載體用T4DNA連 接酶連接，連接體系及條件參見使用說明書；
[0024] (5)轉(zhuǎn)化；將連接產(chǎn)物加入到預(yù)先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞HT115中，冰浴 SOmin后42°C熱激Imin,然后冰浴2min，向感受態(tài)細胞中加入500ULLB培養(yǎng)基，37°C、 200巧m搖Ih使細菌復(fù)蘇；
[00巧](6)將上步菌液1000 g常溫離必2min，留取150UL上清涂布于含有卡郝霉素的平 板培養(yǎng)基上（含40yL20mg/mLIPTG)，37°C正置培養(yǎng)1. 5-化，然后倒置培養(yǎng)12~1化至 平板上長出菌落；
[0026] (7)單克隆培養(yǎng)；用牙簽小必挑取大小合適的白色單菌落于1. 5血邱pendo計管 (盛有含卡郝霉素的LB液體培養(yǎng)基）中，37 C、200rpm/min搖蕩4~化進行擴大培養(yǎng)（直 至菌液渾濁）；
[0027] (8)陽性鑒定：
[002引 PCR反應(yīng)體系如下：
[0031] PCR反應(yīng)條件為；94°C預(yù)變性3min，94°C 50sec，55°C 50sec，72°C 50sec，34個循 環(huán)；72°C延伸 10min，12°C保存；
[0032] 所得PCR產(chǎn)物，經(jīng)I. 2%瓊脂糖電泳檢測，若出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶即為陽性；將呈 陽性結(jié)果的菌液送公司進行測序，確定表達載體構(gòu)建成功；
[0033] (9)表達條件的摸索：將12ml卡郝霉素抗性的培養(yǎng)基按1:100的體積比加入菌液 中，進一步培養(yǎng)；當ODe。。= 0. 5~0. 8 (優(yōu)選0. 6)時吸出1血作對照，然后加入IPTG誘導(dǎo)， 終濃度為lmM，按誘導(dǎo)后l、2、3、4、5、6、8、l化取樣，樣品-7(rC保存待用。用化izol方法提 取總RNA，經(jīng)1. 2 %瓊脂糖電泳檢測。
[0034] 本發(fā)明還提供含有所述表達載體祀T30S的宿主細胞。
[0035] 本發(fā)明還提供含有所述表達載體祀T30S的工程菌，例如大腸桿菌HT115。
[0036] 本發(fā)明還提供表達載體祀T30S在基因沉默中的應(yīng)用，將目的dsRNA克隆至表達載 體祀T30s中，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化作物或大腸桿菌HTl15,通過飼喂害蟲表達目的dsRNA的作物 或大腸桿菌來沉默害蟲特定基因的表達。
[0037] 本發(fā)明進一步提供表達載體祀T30S在制備基因藥物中的應(yīng)用。
[0038] 本發(fā)明涉及一種dsRNA表達載體祀T30S，該載體能夠可控制的表達目的dsRNA。目 的基因可連接到祀T30S形成重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)，通過喂食轉(zhuǎn)入該 重組質(zhì)粒的大腸桿菌，進而將目的dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)，從而達到研究基因功能和防治害 蟲的目的。
[0039] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點：
[0040](一）特異性強，載體祀T30S在制備過程中盡可能的去除了表達區(qū)域的多余序 列，使得表達產(chǎn)物中非特異序列盡量縮減，在一定程度上減少非目的基因片段造成的脫祀 效應(yīng)。
[0041](二）可調(diào)控性高，載體祀T30S具有正反雙向乳糖操縱子，可W有目的地調(diào)控載體 表達雙鏈RNA。
[0042] (H)操作簡單，載體祀T30S構(gòu)建過程中涉及到的技術(shù)均為傳統(tǒng)分子生物學技術(shù)， 技術(shù)成熟。
[004引（四）使用范圍廣，幾乎可W有目的地表達任意基因的雙鏈RNA。
[0044](五）成本低，本發(fā)明中使用的酶均為分子生物學實驗過程中常用的酶。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明表達載體祀T30s的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0046] 圖2為本發(fā)明實施例2中綠色英光蛋白GFP的PCR擴增結(jié)果圖。
[0047] 圖3為本發(fā)明實施例2中GFP的PCR擴增產(chǎn)物與祀T30S的雙酶切電泳圖。
[0048] 圖4為本發(fā)明實施例2中采用祀T30S插入GFP片段后的總RNA電泳圖。
【具體實施方式】
[0049]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件