擬南芥維生素B1合成酶基因AtTHI1在植物生長發(fā)育和抗干旱中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種擬南芥維生素Bl(VBl)合成酶基因的應(yīng)用，尤其涉及擬南芥維生素B1合成酶基因AtTHIl(Gene ID:835567)在植物生長發(fā)育和調(diào)控氣孔運(yùn)動及抗干旱中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]通過生物信息學(xué)對已公布的擬南芥維生素B1合成酶基因AtTHIl基因序列(Gene ID:835567)分析，表明其編碼維生素B1 (VB1)合成代謝酶THI1。VB1又稱硫胺素(Thiamine)，是生物體內(nèi)一種重要的代謝物質(zhì)，其二磷酸鹽TDP是許多重要酶的輔因子。
[0003]已知的研究結(jié)果表明擬南芥維生素B1合成酶基因AtTHIl在植物保衛(wèi)細(xì)胞中大量表達(dá)。但是通過檢索和對已經(jīng)有AtTHIl基因序列的公布及VB1合成功能的分析，有關(guān)擬南芥維生素B1合成酶基因AtTHIl在植物生長發(fā)育和調(diào)控氣孔運(yùn)動及抗干旱中的應(yīng)用還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有研究的不足，本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥維生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生長發(fā)育和調(diào)控氣孔運(yùn)動及植物抗干旱中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所述擬南芥維生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生長發(fā)育和調(diào)控氣孔運(yùn)動及植物抗干旱中的應(yīng)用。
[0006]其中:所述擬南芥硫胺素(VB1)合成酶基因AtTHIl核苷酸序列見GeneID:835567，所述植物優(yōu)選是十字花科植物，所述十字花科植物優(yōu)選是擬南芥、芥菜、油菜、白菜或甘藍(lán)。
[0007]本發(fā)明首先驗證AtTHIl基因的表達(dá)突變體CS3573和CS3590為有效突變，通過生長實(shí)驗，證明AtTHIl的正常表達(dá)對植物的生長發(fā)育必不可少(結(jié)果見圖1)。然后根據(jù)已公布的AtTHIl基因核苷酸序列(Gene ID:835567)，通過RT-PCR技術(shù)從擬南芥中克隆基因AtTHI 1。利用得到的基因片段構(gòu)建植物表達(dá)載體pSTART-THI 1，經(jīng)過分子學(xué)和遺傳學(xué)操作獲得AtTHI過表達(dá)植株(命名為THI1-0E-8、THI1-0E-14)。經(jīng)氣孔運(yùn)動、離體葉片失水、植物抗干旱等生理性狀分析，闡明AtTHIl的過表達(dá)降低植物對脫落酸(ΑΒΑ)促進(jìn)氣孔關(guān)閉過程的敏感性，使轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片失水率降低，抗干旱能力增強(qiáng)(結(jié)果見圖2、圖3)，進(jìn)一步證實(shí)擬南芥維生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在調(diào)控氣孔運(yùn)動及植物抗干旱中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明首次闡明了擬南芥維生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生長發(fā)育和調(diào)控氣孔運(yùn)動及植物抗干旱中的應(yīng)用，為利用AtTHIl基因調(diào)控氣孔的張開和閉合以實(shí)現(xiàn)調(diào)控植物體內(nèi)的保水性及抗干旱能力奠定了基礎(chǔ)，預(yù)示本發(fā)明的應(yīng)用將有助于改良植物的抗旱脅迫能力，對培育抗旱高產(chǎn)的作物新品種有重要的理論指導(dǎo)意義，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有巨大應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0009]圖1:AtTHIl突變體影響植物生長發(fā)育
[0010]在正常培育條件下(無VB1添加)，AtTHIl突變體(CS3573，CS3590)生長10天的小苗真葉發(fā)生白化，后期枯萎，不能完成正常的生長周期；外源添加VB1的條件下，AtTHIl突變體(CS3573，CS3590)可以保持正常的生長，30天后，同野生型(Col_0)保持一樣的生長狀態(tài)。說明AtTHIl在植物體內(nèi)VB1合成過程中起到重要的作用，發(fā)生突變后會導(dǎo)致植物條件性致死。
[0011]圖2:AtTHIl過表達(dá)植株離體葉片失水率降低。
[0012]其中A:THI1基因表達(dá)量水平鑒定；B:氣孔開度統(tǒng)計結(jié)果；C:植株離體葉片失水率結(jié)果。
[0013]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，得到THI1過表達(dá)植株THI 1_0E_8、THI1-0E-14，兩者體內(nèi)THI1的表達(dá)量明顯高于野生型Col-Ο (如圖2-A)。
[0014]在ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉過程中ΤΗΙ1-0Ε-8、ΤΗΙ1-0Ε-14的氣孔開度比野生型(Col_0)小，對ΑΒΑ的作用過敏感(如圖2-Β);另外，與野生型(Col-Ο)對比，AtTHIl過表達(dá)植株(THI1-0E-8.THI1-0E-14)離體葉片失水減慢(如圖2-C)。說明AtTHIl過表達(dá)后促進(jìn)ΑΒΑ誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過程，進(jìn)而減少植物體內(nèi)水分散失。
[0015]圖3:AtTHIl過表達(dá)提高植物抗旱性
[0016]干旱處理下，與野生型(Col-Ο)對比，AtTHIl過表達(dá)植株(THI1-0E-8、THI1-0E-14)抗干旱能力增強(qiáng)，同樣干旱條件下存活率更高(如圖3)。說明AtTHIl過表達(dá)提高植物的抗干旱能力，在培育抗逆高產(chǎn)作物新品種中有重要的應(yīng)用潛質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下實(shí)施例用于闡明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照產(chǎn)品制造生產(chǎn)廠商的使用說明。
[0018]實(shí)施例1擬南芥AtTHIl突變體的獲得和分子鑒定
[0019]1，訂購AtTHI 1突變體
[0020]通過擬南芥生物信息學(xué)網(wǎng)站TAIR(http://www.arabidopsis.0rg/)，查詢 AtTHIl突變體，選取CS3573，CS3590兩個獨(dú)立株系進(jìn)行驗證和后續(xù)實(shí)驗分析。
[0021]2，測序驗證突變體中AtTHIl基因核苷酸序列
[0022]首先提取突變體總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0023]PCR所用到的上游引物和下游引物分別是:
[0024]THI1-F:5’ -ATGGCTGCCATAGCTTCT-3’
[0025]THI1-R:5’-TTAAGCATCTACGGTTTCAG-3’
[0026]PCR產(chǎn)物送博尚公司測序。
[0027]測序結(jié)果證明，CS3573，CS3590突變體中，AtTHIl基因序列分別發(fā)生核苷酸替換和缺失，導(dǎo)致AtTHIl無法按照正常密碼子序列翻譯表達(dá)蛋白。
[0028]實(shí)施例2擬南芥AtTHIl過表達(dá)植株獲得
[0029]1，PCR方法克隆AtTHIl基因片段
[0030]以擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以下面引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0031 ] THI 1-0E-F:5’ -TAGGATCCATGGCTGCCATAGCTTCT-3’
[0032]THI1-0E-R:5’-GTGAGCTCTTAAGCATCTACGGTTTCAG-3’
[0033]PCR產(chǎn)物電泳檢測，切膠回收目的條帶，純化得到AtTHIl基因片段。
[0034]2，載體連接和轉(zhuǎn)化
[0035]首先用純化后的AtTHIl基因片段連接中間克隆載體Blunt (北京全式金公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過抗生素篩選和菌落PCR得到陽性克??；連接后的Blunt載體進(jìn)行測序，獲得測序完