一種hla-b*1502檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及卡馬西平個體化用藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種HLA-B*1502檢測 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡馬西平是常見的抗精神性藥物，臨床上主要用于抗癲癇，也可用于三叉神經(jīng) 痛等。在某些個體當(dāng)中，卡馬西平會導(dǎo)致史蒂文斯 -約翰遜綜合征（StevensJohnson syndrome，SJS)和中毒性表皮壞死溶解癥（toxicepidermalnecrolysis，TEN)，這是一種 嚴(yán)重的皮膚和粘膜反應(yīng)，可導(dǎo)致永久性殘疾甚至致命。在白種人中，由卡馬西平引起的SJS/ TEN的幾率很低，只有萬分之一到萬分之三，然而，在一些亞洲國家，包括南亞的印度人，患 者服用卡馬西平而導(dǎo)致的SJS/TEN較白種人高出10倍左右。
[0003] 現(xiàn)已證實，SJS/TEN風(fēng)險的增加與HLA-B*1502有關(guān)，并且這種關(guān)聯(lián)性與個體中 HLA-B*1502純合還是雜合無關(guān)，HLA-B*1502等位基因幾乎僅存在于有亞裔血統(tǒng)的人群 中。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)建議，在開始使用卡馬西平治療之前，應(yīng)對患者進(jìn)行 HLA-B*1502等位基因檢測，如經(jīng)檢測結(jié)果呈陽性，則不宜使用卡馬西平，除非藥品的預(yù)期收 益明顯大于嚴(yán)重皮膚反應(yīng)風(fēng)險的增加。
[0004] 中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA)在2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點 基因檢測技術(shù)指南（試行）》中明確指出，"攜帶HLA-B*1502等位基因者慎用卡馬西平和苯 安英"。
[0005] 目前對HLA-B*1502的檢測主要有直接測序法（PCR-SBT)、PCR-SSP法以及熒光定 量法。直接測序法優(yōu)點是直觀，可直接獲取待檢者的具體HLA類型，但是操作繁瑣，所需試 劑和設(shè)備均被國外企業(yè)壟斷，價格不菲，并且由于需要經(jīng)常性的開管，很容易造成樣本之間 的交叉污染，因此不適宜大規(guī)模推廣；PCR-SSP法成本較低，操作簡單，可準(zhǔn)確得鑒定待測 樣本是否含有HLA-B*1502等位基因，然而它最終也需要開管檢測，進(jìn)而增加樣本間污染的 可能性，因此也不是檢測大量樣本的最理想方法；熒光定量法有很高的靈敏度，可快速準(zhǔn)確 得進(jìn)行分型，但需要比較昂貴的設(shè)備和探針。因此，探討檢測HLA-B*1502的新方向、新方 法、新技術(shù)很有必要。
[0006] 研究發(fā)現(xiàn)，在HLA-B基因座附近存在與某些亞型高度連鎖的SNP，S卩"標(biāo)簽SNP"， HLA-B*1502的標(biāo)簽SNP是rsl0484555的C等位基因，二者的特異性可達(dá)99. 27%。因此， 通過檢測標(biāo)簽SNP來檢測樣本的HLA-B的基因型是一種新的研究方向。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技術(shù)是日本 科學(xué)家于2000年開發(fā)出來的一種恒溫擴(kuò)增技術(shù)，針對靶基因的六個區(qū)域設(shè)計四條特異性 引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫擴(kuò)增，可在十幾分鐘到一小時之內(nèi)產(chǎn)生109-101(]數(shù) 量級的產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼直接觀察體系狀態(tài)的改變來判定待測樣本的基因型，無 需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可以有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水 浴鍋即可開展檢測，又節(jié)約了大量的檢測成本。因此，采用LAMP方法檢測HLA-B*1502的基 因型是一種新型且適于大規(guī)模使用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的HLA_B*1502檢測方法不理想，不適于大規(guī)模推廣 使用。
[0009] 為解決上述問題，本發(fā)明在LAMP的基礎(chǔ)上采用等位基因特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 (Allele-SpecificLAMP)技術(shù)，針對HLA-B*1502的標(biāo)簽SNP進(jìn)行檢測，提供了一種適于推 廣使用的試劑盒及檢測方法。
[0010] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種HLA-B*1502檢測引物，用于檢測rsl0484555 的C等位基因，包括以下引物：
[0011]5'-AAATTGTTAAAGGTACTTGGAAAG-3，（SEQ IDNo.1，以下簡稱F3)
[0012]5'-CATCTAAAGTATACAATTCAATGGTT-3，（SEQ IDNo.2,以下簡稱B3)
[0013] 5 r -GCCATGAAGTAAATCCATAAATTTTGAGTTTGTGCCTGTCAAGCTAGGA-3 r (SEQ ID No.3,以下簡稱FIP)
[0014] 5，-AGAGAGACATATTATAAAGCCGTGGATCATATTCAGAGTTTTAAATCTGCA-3，（SEQ ID No. 4,以下簡稱BIP)。
[0015] 本發(fā)明提供的引物中，F(xiàn)IP是針對rsl0484555的C等位基因的特異引物，在其中 額外引進(jìn)了一個突變，增加了引物的特異性，降低了非特異擴(kuò)增的可能性，提高了檢測的準(zhǔn) 確性。
[0016] 優(yōu)選地，所述F3、B3、FIP、BIP均為HPLC純化法純化后的引物。
[0017] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種HLA_B*1502檢測試劑盒。所述試劑盒包括檢 測rsl0484555位點基因型進(jìn)而檢測HLA-B*1502的組合物，所述組合物包括上述的引物，還 包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0018] 進(jìn)一步地，所述組合物還包括用于顯示組合物顏色的指示劑。
[0019] 優(yōu)選地，所述指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物或者為羥基萘酚藍(lán)。
[0020] 進(jìn)一步地，所述檢測組合物還包括甜菜堿或二甲基亞砜中的一種。其中，甜菜堿的 濃度大于0,小于等于1M。二甲基亞砜的濃度大于0,小于等于10% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0021] 優(yōu)選地，所述組合物中甜菜堿的濃度為0. 8M。
[0022] 優(yōu)選地，所述組合物中，F(xiàn)3和B3均為0. 4 μΜ，F(xiàn)IP和BIP均為1. 6 μΜ。
[0023]進(jìn)一步地，所述緩沖液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，（NH4)2S0410mM，MgS044mM， Tween_2〇0. 1 % (體積分?jǐn)?shù)）。
[0024] 優(yōu)選地，若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物，鈣黃綠素為25μΜ，氯化錳為 0. 5mM。若指示劑為羥基萘酚藍(lán)，其為120μΜ。
[0025] 優(yōu)選地，所述組合物中dNTP為1. 4mM，Bst聚合酶為8U。
[0026] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種HLA-B*1502的檢測方法。所述檢測方法，使用 上述的HLA-B*1502檢測試劑盒，具體為：將待檢測的核酸加入到所述組合物中，得到的反 應(yīng)體系于55~70°C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后觀察體系的變化。
[0027] 進(jìn)一步地，所述待檢測的核酸在反應(yīng)體系中的濃度為0.8~4ng/μL。
[0028] 優(yōu)選地，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系進(jìn)行滅活處理。滅活處理使得體系中的酶失活， 防止體系放置時間長時發(fā)生非特異性擴(kuò)增，影響反應(yīng)結(jié)果的判斷。
[0029] 優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為58~65 °C。
[0030] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時間為40~120min。
[0031] 在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，反應(yīng)前體系為澄清狀態(tài)，發(fā)生陽性反應(yīng)時，鎂離子與副產(chǎn) 物焦磷酸形成沉淀，體系產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，變?yōu)闇啙釥顟B(tài)。觀察體系狀態(tài)的變化可以直 接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0032]當(dāng)體系中存在指示劑時：（1)若指示劑為羥基萘酚藍(lán)，反應(yīng)前體系中的鎂離子與 dNTP螯合，體系呈現(xiàn)紫羅蘭色；當(dāng)有陽性反應(yīng)時，鎂離子與副產(chǎn)物焦磷酸形成沉淀，溶液pH 發(fā)生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色；（2)若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物 時，反應(yīng)前鈣黃綠素與氯化錳中的錳離子結(jié)合，體系呈現(xiàn)黃色；當(dāng)有陽性反應(yīng)時，副產(chǎn)物焦 磷酸與錳離子結(jié)合生成沉淀，鈣黃綠素與體系中的鎂離子結(jié)合，顏色逐漸由黃色變?yōu)闊晒?綠色。觀察反應(yīng)體系顏色和/或狀態(tài)的變化可以直接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0033] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：（1)本發(fā)明采用Allele-SpecificLAMP技 術(shù)，針對rsl0484555的C等位基因設(shè)計了特異引物，利用rsl0484555的C等位基因與 HLA-B*15021的關(guān)聯(lián)性判斷患者是否攜帶HLA-B*1502等位基因，從而指導(dǎo)卡馬西平個體化 用藥，避免直接測試HLA-B*1502。（2)本發(fā)明運(yùn)用Allele-SpecificLAMP技術(shù)，設(shè)計了特 異引物，測試后，觀察反應(yīng)體系的狀態(tài)變化（是否有沉淀或者顏色的變化）即可判斷是否發(fā) 生陽性反應(yīng)，肉眼即可進(jìn)行判斷，無需額外的裝置設(shè)備，簡便易行，（3)使用本發(fā)明提供的檢 測引物、試劑盒和方法進(jìn)行檢測，所需要的設(shè)備僅是水浴鍋或金屬浴或者熱循環(huán)儀，檢測成 本低；檢測耗時較短；且本檢測方法不需要額外的開管檢測，因此有效避免了交叉污染的 產(chǎn)生，提高了檢測的準(zhǔn)確性。
[0034] 本發(fā)明提供的