一種別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種別嘌呤醇個(gè)體化用 藥檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 別嘌呤醇，是臨床上用來(lái)治療原發(fā)性和繼發(fā)性高尿酸血癥，反復(fù)發(fā)作或慢性痛風(fēng) 以及尿酸性腎結(jié)石和/或尿酸性腎病等疾病的常用藥物。然而，別嘌呤醇在某些個(gè)體中 會(huì)引起嚴(yán)重的皮膚不良反應(yīng)，即Stevens-Johnson綜合征（SJS)和中毒性表皮壞死松解癥 (TEN)。其中，SJS的死亡率可達(dá)5 %，而TEN的死亡率則可高達(dá)35 %，并且50 %的TEN患者 在預(yù)后會(huì)有遠(yuǎn)期的后遺癥。顯然不同的個(gè)體對(duì)別嘌呤醇的耐受有極大的差別。
[0003] 現(xiàn)已研究證實(shí)，服用別嘌呤醇的患者中發(fā)生SJS/TEN的危險(xiǎn)性與HLA-B*5801等位 基因的存在與否密切相關(guān)，因此CIPC規(guī)定凡是HLA-B*5801陽(yáng)性的患者禁止服用別嘌呤醇， 以避免SJS/TEN的發(fā)生。我國(guó)2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指 南（試行）》明確指出，"攜帶HLA-B*5801等位基因者慎用別嘌呤醇，以免引起SJS/TEN"。
[0004] HLA的分型、檢測(cè)目前有PCR-RFLP，PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT等方法。其中 PCR-RFLP只能區(qū)分有限的多態(tài)性；PCR-SSP和PCR-SS0均需大量試劑（引物），且不能識(shí)別 非經(jīng)典的HLA基因和假基因；PCR-SBT法由于有雜合子的干擾，因此很難區(qū)分出不同的單倍 型，而且需要昂貴的設(shè)備和試劑，不適宜大規(guī)模推廣。以上這些方法都不能解決雜合子的問(wèn) 題，而且由于都需要開(kāi)管檢測(cè)，很可能會(huì)帶來(lái)樣本間的交叉污染，而且大規(guī)模的操作也非常 的繁瑣。因此，有必要尋求一種新的檢測(cè)方向和檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是現(xiàn)有的別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)方法難以解決雜合子的 問(wèn)題，且可能帶來(lái)樣本間的交叉感染、檢測(cè)操作繁瑣、成本高，不適于大范圍推廣使用。
[0006]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技術(shù)是 日本科學(xué)家于2000年開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，實(shí)驗(yàn)針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四 條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫?cái)U(kuò)增，可在十幾分鐘到一小時(shí)之內(nèi)產(chǎn)生 109-101°數(shù)量級(jí)的產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)肉眼直接觀察體系狀態(tài)的改變來(lái)判定待測(cè)樣本的 基因型，無(wú)需開(kāi)管，因此大大簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)又可以有效避免樣本交叉污染，而且，僅 需普通水浴鍋即可開(kāi)展檢測(cè)，又節(jié)約了大量的檢測(cè)成本。
[0007] 最近的研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人中，HLA-B*5801與rs9262570的T等位基因緊密連鎖， 其敏感性可達(dá)100%，特異性達(dá)97. 4%。因此可以通過(guò)只檢測(cè)rs9262570的T等位基因而 實(shí)現(xiàn)HLA-B*5801的檢測(cè)，大大降低了檢測(cè)難度和檢測(cè)成本。
[0008] 本發(fā)明在LAMP的基礎(chǔ)上采用等位基因特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Allele-Specific LAMP)技術(shù)，針對(duì)rs9262570的T等位基因設(shè)計(jì)特異引物，并設(shè)計(jì)出了檢測(cè)用的試劑盒及方 法，用于指導(dǎo)別嘌呤醇個(gè)體化用藥。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)引物，用于檢測(cè) rs9262570的T等位基因，包括以下引物：
[0014] 本發(fā)明提供的引物中，F(xiàn)IP是針對(duì)rs9262570的T等位基因的特異引物，同時(shí)又在 特異引物中人為加入一個(gè)點(diǎn)突變，提高了引物的特異性，降低了非特異擴(kuò)增的可能性，提高 了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0015] 優(yōu)選地，所述F3、B3、FIP、BIP均為HPLC純化法純化后的引物。
[0016] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒，包括用于別 嘌呤醇個(gè)體化用藥的檢測(cè)組合物。所述組合物包括上述的引物，還包括dNTP、緩沖液、Bst 聚合酶和超純水。
[0017] 進(jìn)一步地，所述組合物還包括用于顯示組合物顏色的指示劑。
[0018] 優(yōu)選地，所述指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物或者為羥基萘酚藍(lán)。
[0019] 進(jìn)一步地，所述組合物還包括甜菜堿或二甲基亞砜中的一種。其中，甜菜堿的濃度 大于〇,小于等于1M。二甲基亞砜的濃度大于0,小于等于10% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0020] 優(yōu)選地，所述組合物中甜菜堿的濃度為0. 8M。
[0021] 優(yōu)選地，所述組合物中，F(xiàn)3和B3均為0. 4μΜ，F(xiàn)IP和BIP均為1. 6μΜ。
[0022] 進(jìn)一步地，所述緩沖液包括：Tris-HCl20mM，KC1 50mM，（NH4)2S04 10mM，MgS04 4mM,Tween-20 0· 1 % (體積分?jǐn)?shù)）。
[0023] 優(yōu)選地，若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物，鈣黃綠素為25μΜ，氯化錳為 0. 5mM。若指示劑為羥基萘酚藍(lán)，其為120μΜ。
[0024] 優(yōu)選地，所述組合物中dNTP為1. 4mM，Bst聚合酶為8U。
[0025] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種別嘌呤醇個(gè)體化用藥的檢測(cè)方法。所述檢測(cè)方 法，使用上述的別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒，具體為：將待檢測(cè)的核酸加入到所述組合 物中，得到的反應(yīng)體系于55~70°C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后觀察體系的變化。
[0026] 進(jìn)一步地，所述待檢測(cè)的核酸在反應(yīng)體系中的濃度為0.8~4ng/μL。
[0027] 優(yōu)選地，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系進(jìn)行滅活處理。滅活處理使得體系中的酶失活， 防止體系放置時(shí)間長(zhǎng)時(shí)發(fā)生非特異性擴(kuò)增。
[0028] 優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為60 °C。
[0029] 優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為40~120min。
[0030] 在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，反應(yīng)前體系為澄清狀態(tài)，發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，鎂離子與副產(chǎn) 物焦磷酸形成沉淀，體系產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的沉淀，變?yōu)闇啙釥顟B(tài)。觀察體系狀態(tài)的變化可以直 接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0031]當(dāng)體系中存在指示劑時(shí)：（1)若指示劑為羥基萘酚藍(lán)，反應(yīng)前體系中的鎂離子與 dNTP螯合，體系呈現(xiàn)紫羅蘭色；當(dāng)有陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，鎂離子與副產(chǎn)物焦磷酸形成沉淀，溶液pH 發(fā)生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色；（2)若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物 時(shí)，反應(yīng)前鈣黃綠素與氯化錳中的錳離子結(jié)合，體系呈現(xiàn)黃色；當(dāng)有陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，副產(chǎn)物焦 磷酸與錳離子結(jié)合生成沉淀，鈣黃綠素與體系中的鎂離子結(jié)合，體系顏色逐漸由黃色變?yōu)?熒光綠色。觀察反應(yīng)體系顏色和/或狀態(tài)的變化可以直接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0032] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：（1)本發(fā)明在LAMP基礎(chǔ)上采用等位基因特異 性LAMP技術(shù)，針對(duì)rs9262570的T等位基因設(shè)計(jì)了特異引物和包含該引物的試劑盒，利用 rs9262570的T等位基因與HLA-B*5801的關(guān)聯(lián)性判斷患者是否攜帶HLA-B*5801等位基因， 從而指導(dǎo)別嘌呤醇個(gè)體化用藥，解決了現(xiàn)有的檢測(cè)方法中雜合子的干擾。（2)本發(fā)明運(yùn)用 Allele-SpecificLAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異引物，測(cè)試后，觀察反應(yīng)體系的狀態(tài)變化（是否有 沉淀或者顏色的變化）即可判斷是否發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，簡(jiǎn)便易判斷。（3)使用本發(fā)明提供的檢 測(cè)引物、試劑盒和方法進(jìn)行檢測(cè)，所需要的設(shè)備僅是水浴鍋或金屬浴或者熱循環(huán)儀，檢測(cè)成 本低；檢測(cè)耗時(shí)較短；且本檢測(cè)方法不需要額外的開(kāi)管檢測(cè)，因此有效避免了交叉污染的 產(chǎn)生，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒和方法成本低廉、檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確 性尚，易于推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1是檢測(cè)樣本1-9經(jīng)LAMP反應(yīng)得到的產(chǎn)物的電泳圖。
[0034] 圖2-圖10分別是檢測(cè)樣本1-9用PCR-測(cè)序法得到的rs9262570位點(diǎn)的測(cè)序圖 譜。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描 述。
[0036] 一種別嘌呤醇個(gè)體化用藥檢測(cè)引