一種原核生物小rna的高通量文庫(kù)構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建領(lǐng)域，更具 體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種原核生物小RNA的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小RNA是生物體內(nèi)一類具有重要調(diào)控功能的非編碼短小RNA的總稱，主要包括 miRNA、piRNA和siRNA。大量研究已經(jīng)證實(shí)，小RNA幾乎參與調(diào)控了生物所有的生命過(guò)程， 包括細(xì)胞增殖，分化，凋亡等。小RNA測(cè)序正是對(duì)這一類重要的調(diào)控小RNA展開分析，利用 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中的小RNA序列進(jìn)行鑒定和分析。
[0003] 在真核生物中，小RNA以莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在于較長(zhǎng)的RNA轉(zhuǎn)錄物中，后經(jīng)胞漿中的 Dicer核酸酶剪切成22nt左右的RNA分子，真核小RNA測(cè)序就是測(cè)定長(zhǎng)度在18~30nt的小 分子RNA序列。目前，真核小RNA測(cè)序已有多款成熟的試劑盒，如NEBNext?Μμltiplex SmallRNALibraryPrepSet。原核小RNA與真核小RNA有很大不同，其轉(zhuǎn)錄物一般不經(jīng) 過(guò)加工，長(zhǎng)度約為50nt-500nt。目前，針對(duì)原核小RNA測(cè)序，并沒有成熟的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)原核生物小RNA進(jìn)行高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的方法， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)原核小RNA進(jìn)行高質(zhì)量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種針對(duì)原核生物小RNA的高通量測(cè)序文庫(kù) 構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)去除總RNA中的基因組DNA;
[0007] (2)去除總RNA中的rRNA序列；
[0008] (3)使用隨機(jī)引物，以RNA為模板，合成cDNA的第一條鏈；
[0009](4)以cDNA的第一條鏈為模板，合成cDNA的第二條鏈；
[0010] (5)電泳分離原核生物小RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA;
[0011] (6)對(duì)分離的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，加A，加接頭后純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上 機(jī)文庫(kù)純化，構(gòu)建上機(jī)文庫(kù)。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟（1)去除總RNA中的基因組DNA的方法是利用DNaseI 消化RNA樣品中的DNA。DNaseI在37°C下孵育，以消化DNA，實(shí)現(xiàn)RNA樣本中DNA的去除。
[0013] 去除總RNA中的基因組DNA的28μ1反應(yīng)體系為：總RNA1μg，DNaseIReaction Buffer2. 8μ1，DNaseI0. 2U，加無(wú)RNA酶水至28μ1;方法為混勻前述體系，瞬時(shí)離心后 置于 37°C孵育 10_20min。
[0014] 本發(fā)明構(gòu)建方法的步驟⑵中，使用與rRNA序列相匹配的探針與rRNA結(jié)合，以實(shí) 現(xiàn)rRNA的去除，包括以下步驟：1)可吸附探針磁珠的制備，使磁珠吸附探針的性能激活；2) 探針與rRNA的結(jié)合，在70°C下，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)打開，當(dāng)溫度降低到25°C時(shí)，探針與rRNA 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火結(jié)合到一起；3)將可吸附探針的磁珠與退火產(chǎn)物混合在一起， 磁珠在吸附探針時(shí)，會(huì)將與探針結(jié)合在一起的rRNA-同吸附，在磁力架上實(shí)現(xiàn)rRNA的去 除。
[0015] 上述與rRNA序列相匹配的探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)物種rRNA序列設(shè)計(jì)探 針。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的是Ribo-Zero或MICROExpress試劑盒中的探針。
[0016]步驟（2)所述的冰熟包括55、5.85、165、185、235、265、285的冰熟。
[0017] 步驟（3)中，RNA不經(jīng)打斷，直接使用隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。
[0018] 本發(fā)明構(gòu)建方法的步驟（4)中，加入A、T、C、G四堿基合成cDNA第二條鏈，可實(shí)現(xiàn) 非鏈特異性測(cè)序；加入A、U、C、G四堿基合成cDNA第二條鏈，可實(shí)現(xiàn)鏈特異性測(cè)序。
[0019] 所述步驟（5)中，使用低分子量瓊脂糖凝膠電泳分離小RNA，分離的小RNA大小 包括 50-100bp、100-150bp、150-200bp、200-250bp、250-300bp、300-350bp、350-400bp、 400-450bp、450-500bp及其任意組合。
[0020] 本發(fā)明構(gòu)建方法中，在步驟（1)的DNaseI處理后，需要進(jìn)行酶失活與純化操作， 本發(fā)明將酶失活純化與步驟（2)結(jié)合到一起，在70°C孵育時(shí)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了酶失活與RNA二級(jí) 結(jié)構(gòu)的打開，降低了RNA在高溫下降解的可能性。步驟（3)使用隨機(jī)引物作為逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的 引物，使所有類型的RNA都可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在步驟（5)中，低分子量瓊脂糖用來(lái)實(shí)現(xiàn)高分 辨率的DNA分子的分離，通過(guò)加入已知片段大小的DNA標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本DNA大小的度量。 在步驟（6)中，通過(guò)末端修復(fù)酶的聚合特性，補(bǔ)平3'端與5'端，使RNA分子保持完整，通過(guò) 在PCR擴(kuò)增時(shí)的引物上額外的加入5-8個(gè)標(biāo)識(shí)堿基，使不同樣本在測(cè)序時(shí)能夠區(qū)分開來(lái)，通 過(guò)磁珠純化，可以降低成本，節(jié)約時(shí)間。
[0021] 本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)和欲保護(hù)點(diǎn)：（1)是原核小RNA的分離是在逆轉(zhuǎn)錄為cDNA之后進(jìn) 行，將小RNA的分離放置在合成cDNA第二條鏈合成以后，可以極大的降低在RNA水平上分 離引入的RNA降解；（2)是RNA或DNA均不進(jìn)行打斷。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中不經(jīng)過(guò)打斷，可以避 免16S、18S、23S、26S、28S等大片段的rRNA的影響，使測(cè)序數(shù)據(jù)中的rRNA比例降低到10% 以下（常規(guī)比例在30%~60% ); (3)通過(guò)將DNaseI消化與rRNA去除結(jié)合到一起，減少 了純化操作，降低了RNA降解的概率；通過(guò)低分子量瓊脂糖電泳分離原核生物小RNA片段。
[0022] 借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：可以針對(duì)原核生物小 RNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；可以在DNA水平上分離原核生物小RNA，避免在RNA水平上分離造成的 降解；樣本無(wú)需打斷，可獲得全長(zhǎng)原核小RNA文庫(kù)；不依賴于樣本RNA是否有DNA污染；可以 避免樣本中16S、18S、23S、26S、28S等大片段的rRNA的影響，測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA比例在10% 以下；可選擇性的構(gòu)建鏈特異性或非連特異性文庫(kù)。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中樣品1-樣品3在低分子量瓊脂糖上的電泳分離示意圖。
[0024] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中樣品1測(cè)序數(shù)據(jù)的插入片段分布示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式及增益效果。
[0026] 下列實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所有的試劑均來(lái)自NEB。下列實(shí)施例1與實(shí)施例2 分別是對(duì)十五份厭氧細(xì)菌樣品（樣品1-樣品15)與三份恥垢分枝桿菌小RNA進(jìn)行連特異 性文庫(kù)與非鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建的方法。
[0027] 實(shí)施例1十五份厭氧細(xì)菌原核小RNA鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建
[0028] 一、總RNA中DNA的去除
[0029] 1.采用下列28 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行DNA的去除反應(yīng)：
[0030]
[0031] 2.混勻，瞬時(shí)離心后置于37°C孵育15min。
[0032] 二、去除DNA后的RNA樣品中rRNA的去除
[0033] 采用Illumina的Ribo-Zero試劑盒去除rRNA，步驟如下：
[0034] 1.RiboZero?磁珠的準(zhǔn)備
[0035]A.渦旋混勻已室溫平衡30min的磁珠，取225μ1至低吸附無(wú)RNA酶的1. 5ml離心 管，置于磁力架2min至上清液澄清，移棄上清液。
[0036]B.從磁力架上取下離心管，加入225μL已室溫平衡的無(wú)RNA酶水，在管底吹吸十 次混勻，置于磁力架上2min，移棄上清液。
[0037]C.重復(fù)該步驟（2) -次，第二次清洗后用10μ1槍頭將上清液去除干凈。
[0038]D.從磁力架上取下離心管，加入65μL磁珠重懸液，在管底吹吸十次混勻。
[0039]Ε.加入1μ1RiboGuard RNase抑制劑，禍旋混勾。
[0040] 2.探針與rRNA結(jié)合形成探針復(fù)合物
[0041]A.反應(yīng)體系如下：
[0042]
[0043] 吹吸混勻，瞬時(shí)離心后70°C孵育10min，使RNA變性。
[0044] 3.探針復(fù)合物的捕獲與去除
[0045]A.將探針復(fù)合物迅速轉(zhuǎn)移準(zhǔn)備好的磁珠中，并立即渦旋混勻，室溫孵育5min。
[0046]Β·孵育結(jié)束后，置于50°C5min，磁力架上2min至上清液澄清。
[0047]C.轉(zhuǎn)移上清到新的無(wú)RNA酶的1. 5ml離心管，加入無(wú)RNA酶的水補(bǔ)至180μ1
[0048] 4.去除rRNA樣品的純化
[0049]A.反應(yīng)體系如下：
[0050]
[0051] B.渦旋混勻，-80°C放置30min以上或者過(guò)夜。
[0052]C.低溫離心機(jī) 4°C，14000rpm，離心 20min。
[0053]D.移去上清液，加入500μ 1預(yù)冷的70%乙醇，4°C，14000rpm，離心5min。
[0054]Ε·移去上清液，加入8· 5μ1無(wú)RNA酶的水溶解RNA。
[0055] 三、合成cDNA第一條鏈
[0056] 1.反應(yīng)體系如下：
[0057]
[0058] 2.混勻后，瞬時(shí)離心，在PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：25°ClOmin，42°C50min， 70°C15min〇
[0059] 四、合成cDNA第二條鏈
[0060] 1.反應(yīng)體系如下：
[0061]
[0062] 2.混勻后，瞬時(shí)離心，16°C孵育lh。
[0063] 3.使用AMPureXP磁珠純化反應(yīng)產(chǎn)物，具體步驟如下：
[0064]A.將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入1. 5ml低吸附離心管中，加入144μ1已混勻的磁珠，吹吸10次 混勻，旋轉(zhuǎn)混勻儀上5min。
[0065] Β·置于磁力架上靜置5min，移棄上清液。
[0066]C.離心管置于磁力架上，用200μ1新鮮配制的80 %乙醇吹吸6次清洗磁珠，磁力 架上靜置30s，移棄上清液。
[0067]D.重復(fù)清洗一次，第二次清洗后用10μ1槍頭將上清液去除干凈，打開管蓋，空氣 干燥10min〇
[0068] Ε·取下離心管，加入55μ1無(wú)RNA酶水，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力 架上靜置5min，吸取50μ1上清液至新的離心管中。
[0069] 五、分離原核生物小RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA
[0070] 1.使用2 %低分子量瓊脂糖凝膠電泳分離逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，電泳條件為110V， 120min〇
[0071] 2.依據(jù)50bp大小的Marker作為參考，切膠篩選50-250bp大小的cDNA(圖1)。
[0072] 3.使用QIAGEN純化柱回收cDNA，最后加入55. 5μ1的無(wú)RNA酶水溶解DNA。
[0073] 六、末端修復(fù)與加Α，加接頭，構(gòu)建上機(jī)文庫(kù)
[0074] 1.按如下體系配制末端修復(fù)與加Α反應(yīng)：
[0075]
[0076] 2.混勻后，瞬時(shí)離心，20°C孵育30min，65°C孵育30min。
[0077] 3.按如下體系配制加接頭反應(yīng)：
[0078]
[0079] 4.混勻后，瞬時(shí)離心，20°C孵育15min。
[0080] 5.使用AMPureXP磁珠純化反應(yīng)產(chǎn)物，具體步驟如下：
[0081] A.將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1. 5ml低吸附離心管中，加入100μ1已混勻的磁珠，吹吸10次 混勻，旋轉(zhuǎn)混勻儀上5min。
[0082] Β·置于磁力架上靜置5min，移棄上清液。
[0083] C.離心管置于磁力架上，用200μ1新鮮配制的80 %乙醇吹吸6次清洗磁珠，磁力 架上靜置30s，移棄上清液。
[0084] D.重復(fù)清洗一次，第二次清洗后用10μ1槍頭將上清液去除干凈，打開管蓋，空氣 干燥10min〇
[0085] Ε·取下離心管，加入22μ1無(wú)RNA酶水，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力 架上靜置5min，吸取20μ1上清液至新的0. 2ml離心管中。
[0086] 6.按如下體系配制SolexaPCR反應(yīng)：純化產(chǎn)物20μ1
[0087]
[0088] X表示Index引物中的標(biāo)識(shí)堿基，本次實(shí)施例標(biāo)識(shí)堿基如下：
[0089] 樣品 1 :ATCACG
[0090] 樣品 2 :CGATGT
[0091] 樣品 3:TTAGGC
[0092] 樣品 4 :GGA