一種靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干擾中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向型九聚精氨酸及其在核糖核 酸干擾中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在哺乳動物細胞中，核糖核酸干擾（RNA interference, RNAi)是一種廣泛和基 礎(chǔ)的生物過程，并在生理病理過程中起著決定性的作用。在RNAi過程中，小分子非編碼 RNA，如內(nèi)源性的微小核糖核酸（micr〇RNA，miRNA)和外源性的小干擾核糖核酸（small interfering RNA, siRNA)可通過堿基互補配對的原則使它們的祀信使核糖核酸（mRNA)被 降解或抑制它們的翻譯，這種廣泛的對靶基因表達的調(diào)控過程與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相 關(guān)。因而，siRNA和miRNA近年來已經(jīng)被視為可通過RNAi實現(xiàn)治療目的的一類新型的先導 藥物。然而，由于siRNA和miRNA的負電性及不穩(wěn)定性，siRNA和miRNA的細胞內(nèi)運輸仍然 需要額外的載體實現(xiàn)，這就要求所用的載體具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性及運輸操作 過程的簡便性。另外，在運輸過程中如何實現(xiàn)siRNA和miRNA的靶向運輸仍然是一個重要 的需要解決的問題。
[0003] 九聚精氨酸是一類具有優(yōu)良生物相容性的、正電性的陽離子多肽，已被證實具有 較好的細胞膜通透性。本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了可在九聚精氨酸的末端接入靶向細胞膜表 面受體的分子，利用靶向型九聚精氨酸實現(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細胞內(nèi)靶向 運輸，并進而利用核糖核酸干擾達到治療目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干擾中的應(yīng) 用，可實現(xiàn)對小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的靜電包裹進而實現(xiàn)這兩類核糖核酸的細胞 內(nèi)靶向運輸。
[0005] 技術(shù)方案：一種靶向型九聚精氨酸，結(jié)構(gòu)如下：
[0006] R-R-R-R-R-R-R-R-R-X--Y
[0007] 其中R代表L-構(gòu)型的精氨酸，X為連接基團，Y為靶向分子，X-Y連接在九聚精氨 酸的N端或C端，其中X為含一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵 或醚鍵，Y為葉酸、透明質(zhì)酸、鏈狀RGD肽、環(huán)狀RGD肽、RVG肽、TAT肽、MPG肽、EB1肽、EGFR 抗體或HER2抗體。
[0008] 所述的靶向型九聚精氨酸為環(huán)狀RGD修飾的九聚精氨酸，結(jié)構(gòu)式為
[0009]
[0010] 所述靶向型九聚精氨酸在siRNA和miRNA包裹、靶向運輸?shù)膽?yīng)用。
[0011] 所述靶向型九聚精氨酸在包裹siRNA和miRNA后作為制備治療疾病藥物中的應(yīng) 用。
[0012] 所述靶向型九聚精氨酸作為siRNA和miRNA類核糖核酸干擾藥物的靶基因分析中 的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明采用現(xiàn)代分子生物學和化學生物學的方法研究靶向型九聚精氨酸在siRNA 和miRNA細胞內(nèi)靶向運輸中的應(yīng)用。
[0014] (一）siRNA 和 miRNA 的包裹
[0015] 將靶向型九聚精氨酸與siRNA或miRNA稀釋于高糖培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液中，混 勻后置于室溫放置30分鐘。
[0016] (二）siRNA 和 miRNA 的靶向運輸
[0017] 選取細胞膜表面富含上述靶向基團受體的細胞系，將上述得到的靶向型九聚精氨 酸和siRNA或miRNA的混合液加入到細胞中，2小時后將細胞培養(yǎng)液換成正常細胞生長液。 24小時后，提取細胞內(nèi)RNA并用定量RT-PCR對細胞內(nèi)siRNA或miRNA的表達量進行測定。
[0018] (三）熒光素酶實驗
[0019] 通過靶向型九聚精氨酸運輸?shù)膕iRNA和miRNA刺激細胞內(nèi)的熒光素酶信號變化判 斷其生物活性，具體流程如下：
[0020] (1)構(gòu)建含有siRNA或miRNA結(jié)合位點的熒光素酶質(zhì)粒；
[0021] (2)將質(zhì)粒到細胞內(nèi)后，用靶向型九聚精氨酸運輸相應(yīng)的siRNA或miRNA ;
[0022] (3)48小時后測定細胞內(nèi)熒光素酶信號。
[0023] 有益效果：本發(fā)明提供一種靶向型九聚精氨酸可實現(xiàn)對小干擾核糖核酸和微小核 糖核酸的靜電包裹，進而實現(xiàn)這兩類核糖核酸的細胞內(nèi)靶向運輸。利用靶向型九聚精氨酸 運輸上述兩類核糖核酸實現(xiàn)的治療。
【附圖說明】
[0024] 圖1為凝膠電泳分析圖；
[0025] 圖2為納米顆粒尺寸分布圖；
[0026] 圖3為納米顆粒ZETA電位趨勢圖；
[0027] 圖4為透射電鏡分析圖；
[0028] 圖5為U87MG細胞內(nèi)miR-34a運輸定量分析圖；
[0029] 圖6為293T細胞內(nèi)miR-34a運輸定量分析圖；
[0030] 圖7為U87MG細胞熒光素酶實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1、環(huán)狀RGD修飾的九聚精氨酸（9R-RGD)對miR-34a的包裹
[0032] 將 lOOpmole miR-34a 溶解于 100 yL DMEM 中，后將 0· 2,0· 6,1，1. 4,1. 6 yL 5mM 9R-R⑶分別加入到DMEM中，得到五組不同摩爾比的混合液，將混合液置于室溫中放置30分 鐘。
[0033] 凝膠電泳分析
[0034] 配制2%瓊脂糖凝膠，分別取上述混合液進行電泳分析，并用溴化乙錠對miR_34a 進行顯色。從圖1中可見，當9R-R⑶的摩爾比逐漸升高時，miR-34a與其的結(jié)合也在增加。 利用動態(tài)光散射和ZETA電勢分析儀對其進行分析，也證明了隨著9R-R⑶的摩爾比逐漸升 高時納米尺寸的顆粒也在逐漸形成（圖2)，電位也在逐漸變?yōu)檎娦裕▓D3)。透射電鏡圖 表明當摩爾比為50:1時，兩者形成了均一分散的納米顆粒，直徑大約為80nm(圖4)。
[0035] 靶向細胞內(nèi)運輸
[0036] 將U87MG細胞種入12孔板中，24小時后，將含40pmole miR-34a的混合液加入到 細胞培養(yǎng)基中，2小時后將細胞培養(yǎng)液換成含2vt. % FBS，lvt. % PS的高糖DMEM培養(yǎng)液繼 續(xù)培養(yǎng)24小時后，用TRIZ0L提取細胞內(nèi)RNA。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示9R-R⑶的摩爾 比逐漸升高時進入細胞的miR-34a的量也在逐漸增加，當摩爾比達到50:1時基本可以達到 飽和（圖5)。
[0037] 取不含RGD受體的293T細胞作為對照，進行上述相同實驗。在293T細胞中沒有 觀察到類似的結(jié)果（圖6)，表明該方法可以實現(xiàn)miR-34a的靶向運輸。
[0038] miRNA表達量的測定
[0039] 取出1 μ g的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備相應(yīng)的cDNA樣品。具體逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10 μ L 體系為：
[0040] 5x AMV buffer(Takara) 2yL [0041 ] AMV (Takara) 0. 5 μ L
[0042] RT primer (ABI) 0. 5 μ L
[0043] dNTP mixture (Takara) 1 μ L
[0044] DEPC H20 5 μ L
[0045] RNA 1 μ L
[0046] 反應(yīng)程序為：16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min，4°C保存。制備好的 cDNA 再用探 針法（Taqman) PCR對miR-122進行實時定量。20 μ L
[0047] Taqman PCR 反應(yīng)體系為：
[0048] 1 Ox buffer (Takara) 2 μ L
[0049] MgCl2(25mM) (Takara) 1. 2 μ L
[0050] Taq (Takara) 0. 3 μ L
[0051] dNTP mixture (lOmM) 0. 4 μ L
[0052] Probe (ABI) 0. 33 μ L
[0053] cDNA 1 μ L
[0054] Distilled H20 14. 77 μ L
[0055] PCR反應(yīng)程序為95°C 5min，95°C 15s后60°C lmin40個循環(huán)擴增，實時熒光信號均 在每個循環(huán)的60°C采集。
[0056] 熒光素酶實驗
[0057] (1)報告質(zhì)粒的構(gòu)建
[0058] 使用 Hindlll 和 Spel (I Takara)內(nèi)切酶剪切 Luciferase 報告質(zhì)粒（Promega)的 3' UTR端，將得到的片斷進行電泳分離純化。miR-34a的互補序列分別通過DNA連接酶， T4 ligase (Takara)，插入到純化得到的luciferase報告質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌 內(nèi)，再通過含有氨芐的篩選平板篩選得到可能的陽性質(zhì)粒。最終將該報告質(zhì)粒進行測序確 認其正確性（Invitrogen)。
[0059] (2)熒光素酶分析
[0060] 鑒定后的報告質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染進入U87MG細胞中。首先將細胞種到24孔板中，當 細胞密度達到7〇%-8〇%時，將〇.25以8 11^1?-34&報告質(zhì)粒和〇.15以8 0-區(qū)&1&(31:〇81(1&86 內(nèi)參質(zhì)粒用Lipo-2000 fectamine試劑轉(zhuǎn)染進細胞，轉(zhuǎn)染操作遵循Invitrogen產(chǎn)品說明。 在轉(zhuǎn)染4小時后，將20 pmole miR-34a用環(huán)狀RGD修飾九聚精氨酸運輸?shù)郊毎小?小時 后，將細胞培液換成含2vt. % FBS，lvt. % PS的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，測定 luciferase和β -galactosidase內(nèi)參信號。結(jié)果表明以革巴向型九聚精氨酸運輸?shù)膍iR_34a 在進入細胞后仍然具有基因沉默的生物學功能（圖7)。
[0061] 上述【具體實施方式】不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等 效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種祀向型九聚精氨酸，其特征在于結(jié)構(gòu)如下： R-R-R-R-R-R-R-R-R-X-Y 其中R代表k構(gòu)型的精氨酸，X為連接基團，Y為祀向分子，X-Y連接在九聚精氨酸的N端或C端，其中X為含一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫鍵、酷胺鍵、醋鍵或酸鍵， Y為葉酸、透明質(zhì)酸、鏈狀RGD膚、環(huán)狀RGD膚、RVG膚、TAT膚、MPG膚、EB1膚、EGFR抗體或 肥R2抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的祀向型九聚精氨酸，其特征在于為環(huán)狀RGD修飾的九聚精氨 酸，結(jié)構(gòu)式關(guān)3.權(quán)利要求1或2所述祀向型九聚精氨酸在siRNA和miRNA包裹、祀向運輸?shù)膽?yīng)用。4.權(quán)利要求1或2所述祀向型九聚精氨酸在包裹siRNA和miRNA后作為制備治療疾病 藥物中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1或2所述祀向型九聚精氨酸作為SiRNA和miRNA類核糖核酸干擾藥物的 祀基因分析中的應(yīng)用。
【專利摘要】一種靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干擾中的應(yīng)用，結(jié)構(gòu)如下：R-R-R-R-R-R-R-R-R-X-Y，其中R代表L-構(gòu)型的精氨酸，X為連接基團，Y為靶向分子，X-Y連接在九聚精氨酸的N端或C端，其中X為含一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵或醚鍵，Y為葉酸、透明質(zhì)酸、鏈狀RGD肽、環(huán)狀RGD肽、RVG肽、TAT肽、MPG肽、EB1肽、EGFR抗體或HER2抗體。該靶向型九聚精氨酸可實現(xiàn)對小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的靜電包裹進而實現(xiàn)這兩類核糖核酸的細胞內(nèi)靶向運輸。
【IPC分類】A61K31/7088, C07K7/06, A61K48/00, A61K47/42, C07K19/00
【公開號】CN105315345
【申請?zhí)枴緾N201510724576
【發(fā)明人】張艷, 張辰宇, 李金波, 肖瀟, 黃磊, 陳熹
【申請人】南京大學
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年10月29日