一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇最早從短枝紅豆杉（Taxusbreviifolia)的樹皮中分離得到，命名為紫杉 醇。紫杉醇隨后被證實具有獨特的抗癌機制，由于其獨特的抗癌機制，對于普通抗癌藥物 無能為力的某些晚期腫瘤均有良好療效，并且對于多種臨床惡性腫瘤療效突出，完全不同 于以往上市的任何一種抗癌藥。美國食品與藥物管理局（FDA)于1992年12月正式批準(zhǔn)紫 杉醇用于臨床。
[0003] 由于紅豆杉已經(jīng)作為瀕危物種被列為國家一級保護植物，顯然從紅豆杉植物組織 中提取紫杉醇已受到極大的限制，同時紅豆杉樹皮中紫杉醇含量很低，藥源極其有限，遠不 能滿足臨床用藥需要。紅豆杉細胞組織培養(yǎng)需要的條件嚴(yán)格且產(chǎn)量低而化學(xué)合成成本昂 貴，因此這兩種途徑均不適合大量獲取紫杉醇。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇，它是不需依賴 紅豆杉而極具工業(yè)化生產(chǎn)潛力的方法，但是通過目前所具有的方法篩選出來的紫杉醇菌產(chǎn) 紫杉醇的含量低，并不能滿足工業(yè)要求。因此，尋求一種從紅豆杉分離到產(chǎn)紫杉醇效率高的 內(nèi)生真菌，將會為紫杉醇的微生物工程提供一條更廣闊的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種從紅豆杉分離到產(chǎn)紫杉醇效率 高的內(nèi)生真菌的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)對紅豆杉植物的組織進行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌；
[0008] 2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對發(fā)酵代謝物進行初篩，篩出可 產(chǎn)紫杉醇或其類似物的菌株；
[0009] 3)結(jié)合細胞毒性實驗，測定出代謝物對CH0細胞的抑制率；
[0010] 4)利用高效液相色譜做進一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0011] 上述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的步驟，優(yōu)選為：
[0012] 1)對紅豆杉植物的組織消毒后在固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)數(shù)天到數(shù)十天，分離純化 獲得內(nèi)生真菌，并做空白對照試驗排除空氣中真菌；
[0013] 2)液體培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代 謝物進行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類似物的菌株；
[0014] 3)結(jié)合細胞毒性實驗，用Resazurin法檢測生長抑制率，對經(jīng)初步篩選出的次生 代謝產(chǎn)物進行體外抗腫瘤活性試驗，測定出代謝物對CH0細胞的抑制率；
[0015] 4)通過高效液相色譜做進一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0016] 上述的紅豆杉植物的組織是樹皮、樹葉或果實。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法獲得的產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0018] 上述產(chǎn)紫杉醇菌株已于2014年5月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號）保藏號為CGMCC No. 9251。 該保藏的生物材料的分類命名為：木霉（Trichoderma sp.)。
[0019] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有上述產(chǎn)紫杉醇菌株的生物制劑。
[0020] 本發(fā)明提供的篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，可根據(jù)內(nèi)生真菌培養(yǎng)的需要調(diào)整固體培養(yǎng) 基的營養(yǎng)成分和最佳的內(nèi)生真菌生長環(huán)境條件，盡可能多培養(yǎng)出產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。同 時做了空白對照實驗，排除空氣中的真菌的干擾影響。然后通過TLC和HPLC檢測并結(jié)合腫 瘤模型實驗篩選來確定產(chǎn)紫杉醇菌，能盡快使從真菌發(fā)酵途徑獲取紫杉醇擴大實驗提供有 價值的實驗參考數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明提供的從黃山地區(qū)紅豆杉果實中培養(yǎng)并篩選產(chǎn)紫杉醇 菌的技術(shù)是高效、操作簡單和切實可行的方法。該方法篩選產(chǎn)紫杉醇菌用于微生物培養(yǎng)獲 得紫杉醇的含量大大增加，為微生物工程提供了更廣闊的途徑。
[0021] 可見，將本發(fā)明提供的方法對我國這些珍稀藥用植物的內(nèi)生真菌進行的研究和開 發(fā)，對于開發(fā)我國植物內(nèi)生真菌的藥用資源以及瀕危藥用植物的生態(tài)保護等均具有重要的 理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0022] 圖1為薄層層析對這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝物進行分析的初篩圖。
[0023] 圖2為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
[0024] 圖3為HQ-24代謝物的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0026] 實施例
[0027] 將新鮮的黃山地區(qū)紅豆杉果實切成1cm2小塊。把果實浸泡于75%酒精5min左右， 接種于如下平板培養(yǎng)基中：馬鈴薯20gL \葡萄糖20gL \瓊脂20gL 1和葡萄糖40gL \蛋白 胨10gL \酵母浸出粉10gL \瓊脂20gL \在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天。待菌落從切口處長出 后，觀察培養(yǎng)皿中材料切口處長出菌絲（菌落），挑取切口處菌絲尖端轉(zhuǎn)接到新的平板培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，待長成菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異及長出時間的不同，分別挑取其邊緣 的菌絲進行分離培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應(yīng)記錄。采用菌絲 頂端純化法如此反復(fù)純化后，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基上，于28 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，對菌株進 行編號，并放入4°C冰箱保存。將分離純化后得到的菌株進行液體培養(yǎng)，25°C，轉(zhuǎn)速為120r/ min搖床中培養(yǎng)10d。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液抽濾，分離出發(fā)酵液。發(fā)酵液采用低溫真空濃縮處 理，濃縮至原體積的1/5后用等體積的乙醚和乙酸乙酯萃取多次后，將有機相濃縮近于lml 備用。
[0028] 用紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對照，樣品用毛細管在GF254高效薄層硅膠板點樣，點 樣后放入層析缸中展開，層析后取出硅膠板，在薄層板上噴顯色劑，再觀察斑點的位置和顏 色，結(jié)果見圖1，通過該圖可發(fā)現(xiàn)共有8個菌株（分別為HQ-2、HQ-5、HQ-41、HQ-67、HQ-24、 HQ-40、HQ-69、HQ-71)的發(fā)酵液提取物在薄層板上均能產(chǎn)生紫杉醇的特征性斑點出現(xiàn)，根據(jù) 原點至主斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（Rf)，其比移值Rf均與紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn) 品相同。對經(jīng)TLC篩選出的8株經(jīng)醇沉處理的篩選出紅豆杉內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液凍干品用 12. 5%的DMSO配成1. Omg/ml的樣品溶液，用CHO Cytotoxicity Assay模型進行測定，樣 品的測試終濃度為100 μ g/ml。對經(jīng)上述篩選出的代謝產(chǎn)物進行體外抗腫瘤活性試驗，于 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。酶標(biāo)儀檢測，測定出代謝物對CH0細胞的抑制率。測定結(jié) 果見表1，表明8株菌株的代謝物對CH0細胞的抑制率均較大，可見該菌株的代謝物細胞毒 活性較大。其中HQ-24的代謝物對CH0細胞的抑制率達到70%以上，該菌株的代謝物細胞 毒活性最大。
[0029] 表1 8株紅豆杉內(nèi)生真菌代謝物對CH0細胞的細胞毒性
[0031] 再通過高效液相色譜對抑制率較高發(fā)酵物（HQ-24)做了進一步分析，利用HPLC建 立紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2和圖3,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HQ-24菌株發(fā)酵代謝物的吸收峰與紫杉醇 標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時間一致，可確定該菌為產(chǎn)紫杉醇菌?？梢姡渌麡悠芬簿鶠楫a(chǎn)紫杉醇 菌，最后對產(chǎn)紫杉醇菌進行鑒定，屬于木霉（Trichoderma sp.)。
【主權(quán)項】
1. 一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如下步驟： 1) 對紅豆杉植物的組織進行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌； 2) 培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對發(fā)酵代謝物進行初篩，篩出可產(chǎn)紫 杉醇或其類似物的菌株； 3) 結(jié)合細胞毒性實驗，測定出代謝物對CHO細胞的抑制率； 4) 利用高效液相色譜做進一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如 下步驟： 1) 對紅豆杉植物的組織消毒后在固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)數(shù)天到數(shù)十天，分離純化獲得 內(nèi)生真菌，并做空白對照試驗排除空氣中真菌； 2) 液體培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝物 進行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類似物的菌株； 3) 結(jié)合細胞毒性實驗，用Resazurin法檢測生長抑制率，對經(jīng)初步篩選出的次生代謝 產(chǎn)物進行體外抗腫瘤活性試驗，測定出代謝物對CHO細胞的抑制率； 4) 通過高效液相色譜做進一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，所述 紅豆杉植物的組織是樹皮、樹葉或果實。4. 通過權(quán)利要求1所述的方法所獲得的產(chǎn)紫衫醇菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)紫衫醇菌株，其保藏號為CGMCCNo. 9251。6. 含有權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)紫衫醇菌株的生物制劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟：1)對紅豆杉植物的組織進行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌；2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對發(fā)酵代謝物進行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類似物的菌株；3)結(jié)合細胞毒性實驗，測定出代謝物對CHO細胞的抑制率；4)利用高效液相色譜對其作了進一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。本發(fā)明提供的從紅豆杉分離產(chǎn)紫杉醇的方法過程簡單，成本較低。并且通過本發(fā)明提供的方法提取得到的產(chǎn)紫杉醇菌用于微生物培養(yǎng)時，獲得紫杉醇的含量大大增加，該方法為微生物工程提供了更廣闊的途徑。CGMCC No925120140526
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/885
【公開號】CN105316238
【申請?zhí)枴緾N201410300629
【發(fā)明人】汪友明, 樊美珍, 馬忠友, 胡豐林, 張袖麗, 田超, 陸瑞利
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月25日