人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成 纖維細(xì)胞的一類細(xì)胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細(xì)胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便、無(wú)免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無(wú)致瘤性，具有其它干細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢(shì)， 因此，探討MSCs體外大量擴(kuò)增具有深遠(yuǎn)意義。
[0003]目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增多采用二維培養(yǎng)方式進(jìn)行的，也有部分采用三 維細(xì)胞培養(yǎng)支架進(jìn)行培養(yǎng)，但均是采用單一的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架，由于單一的三維細(xì)胞培 養(yǎng)支架存在機(jī)械性能弱，不穩(wěn)固等問(wèn)題，因此，在培養(yǎng)過(guò)程中，容易從三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的 三維培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變成二維培養(yǎng)方式，從而使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性差，擴(kuò)增不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維支架培養(yǎng)骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞的方法因支架機(jī)械性能弱，不穩(wěn)固等造成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增率不高、細(xì)胞 活性差等缺陷，提供一種能夠采用兩種及以上三維支架的人工模擬骨髓微環(huán)境進(jìn)行骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0006] 獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用三維細(xì)胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0007] 其中，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架是由膠原和殼聚糖，或膠原和賴氨酸組合制成；或， 所述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架是由膠原與殼聚糖和戊二醛三者共同制成的。
[0008] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，所述三維 細(xì)胞培養(yǎng)支架中還添加有納米晶膠原基骨或脫細(xì)胞軟骨。
[0009] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，由所述膠 原和殼聚糖制備三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的過(guò)程包括以下步驟：
[0010] 將膠原溶于乙酸溶液中，配制膠原溶脹液；將殼聚糖溶于乙酸中，配制殼聚糖溶 液，然后將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合脫泡，冷凍并凍干。
[0011] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，由所述膠 原和賴氨酸制備三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的過(guò)程包括以下步驟：
[0012] 將膠原溶于乙酸溶液中制成膠原溶脹液，經(jīng)真空脫泡，冷凍并凍干處理后，浸泡于 含有賴氨酸的MES溶液中，然后再添加 EDAC交聯(lián)劑和含NHS氨基酸保護(hù)劑，交聯(lián)處理后漂 洗，然后冷凍并干燥。
[0013] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，由所述膠 原、殼聚糖和戊二醛制備三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的過(guò)程包括以下步驟：
[0014] 將膠原溶于乙酸溶液中，配制成膠原溶脹液；并用乙酸溶液配制殼聚糖溶液，然后 將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合并放置于真空中干熱交聯(lián)后浸泡于戊二醛溶液中，繼續(xù)交 聯(lián)8-16個(gè)小時(shí)后，漂洗，冷凍并凍干。
[0015] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細(xì) 胞，PBS緩沖液離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟還包括對(duì)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的過(guò)程，包括以下步 驟：
[0017] 將原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞濃度調(diào)整至IX 106~IX 10 8個(gè)/25ml，加入所述培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合時(shí)，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，見(jiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后， 加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，按1 :2~1 :3比例接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng) 到融合，繼續(xù)傳代至獲得第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0018] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，采用三維 細(xì)胞培養(yǎng)支架進(jìn)行體外培養(yǎng)的步驟為：取三維細(xì)胞培養(yǎng)支架復(fù)溶，取第三代骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1 X 10s~1 X 10 w個(gè)/L細(xì)胞濃度與復(fù)溶后三維細(xì)胞培 養(yǎng)支架共同接種于所述培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0019] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，三維細(xì)胞 培養(yǎng)支架復(fù)溶過(guò)程中，還添加有助溶劑，且所述助溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% -15%。
[0020] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，所述培養(yǎng) 基為血清培養(yǎng)基，且所述血清培養(yǎng)基中添加有10 6~10 smol/L的氫化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。
[0021] 實(shí)施本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，可以達(dá)到 以下有益效果：通過(guò)采用殼聚糖或賴氨酸，或是采用殼聚糖和戊二醛對(duì)膠原支架進(jìn)行改性， 以提高三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的機(jī)械性能，使其不易被酶解，并利用其三維多孔結(jié)構(gòu)維持骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中的三維生長(zhǎng)環(huán)境，以更好地模擬適宜骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng) 的骨髓微環(huán)境，并提高三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的細(xì)胞黏附性，使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠黏附 在三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的多孔結(jié)構(gòu)上生長(zhǎng)，擴(kuò)大了細(xì)胞與培養(yǎng)基的接觸面積，從而達(dá)到提高 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性及增值率，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，采用單一三維細(xì)胞培養(yǎng)支架 培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在支架機(jī)械性能弱等缺陷造成細(xì)胞增殖率低、易死亡等問(wèn)題。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在細(xì) 胞活性差，增殖率低等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種采用兩種及以上的三維細(xì)胞培 養(yǎng)支架以人工模擬骨髓微環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，避免了單一的三維細(xì)胞 培養(yǎng)支架機(jī)械性能弱、不穩(wěn)固、生物相容性差、不利于細(xì)胞黏附等問(wèn)題，從而可真正實(shí)現(xiàn)骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)，不僅能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，而且還能夠提高骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增率。
[0023] 具體地，本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括 以下步驟：
[0024] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0025] S2、采用三維細(xì)胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)；其中，三維細(xì)胞培養(yǎng)支架是 由膠原和殼聚糖，或由膠原和賴氨酸組合制成；或，三維細(xì)胞培養(yǎng)支架是由膠原與殼聚糖和 戊二醛三者共同組合制成。
[0026] 膠原具有無(wú)抗原性、及良好的生物相容性，其本身所包含的細(xì)胞黏附信號(hào)肽序列 可以引導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠原支架的特定識(shí)別，有助于保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型 及活性，但由膠原單獨(dú)制作而成的膠原支架存在易酶解、機(jī)械性能差、細(xì)胞黏附性相對(duì)較弱 等缺陷。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于通過(guò)采用殼聚糖或賴氨酸對(duì)膠原進(jìn)行改性，能夠提高膠原的 抗酶解能力，改善膠原的力學(xué)性能，提高支架材料的機(jī)械性能及孔隙率。另外，通過(guò)引入戊 二醛和膠原的氨基酸殘基以及膠原的Η原子發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)這些反應(yīng)使膠原分子相互連接 形成交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)，這樣不但可以提高材料的機(jī)械性能，還可以延緩生物材料的降解速 率；而殼聚糖的引入能夠大大減緩膠原支架的降解速度，以滿足細(xì)胞對(duì)支架材料降解的要 求。
[0027] 而由殼聚糖制成的殼聚糖水凝膠或殼聚糖改性水凝膠均具有生物功能性親水表 面，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖；兩者分別單獨(dú)作為三維細(xì)胞培養(yǎng)支架材料存在機(jī)械性能弱，不 能保持既定性狀，可塑性不強(qiáng)，不能很好的模擬骨髓微環(huán)境的缺陷；而由殼聚糖與膠原支架 共同制成的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架，則能夠增強(qiáng)三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的機(jī)械性能，及生物相容性 及細(xì)胞黏附性，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)及增殖，另外，膠原支架也能夠使骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞保持其干細(xì)胞特性。
[0028] 進(jìn)一步地，為提高三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的機(jī)械性能，本發(fā)明提供的三維細(xì)胞培養(yǎng)支 架中還包括納米晶膠原基骨或脫細(xì)胞軟骨；其中，納米晶膠原基骨具有三維孔洞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 機(jī)械強(qiáng)度較好，且具有一定的生物相容性；而脫細(xì)胞軟骨是生物新鮮組織經(jīng)過(guò)物理方法處 理，脫去組織中的所有細(xì)胞、抗原等物質(zhì)后所得到的產(chǎn)物，主要包括膠原支架、彈性蛋白、非 膠原支架糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，具有良好的生物相容性、柔韌性、低抗原性，在體外 培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)降解變形，保留了培養(yǎng)前的結(jié)構(gòu)，且保留了大量對(duì)細(xì)胞黏附、增殖有利的蛋白 多糖和II型膠原支架等，其力學(xué)性質(zhì)與天然的軟骨很相近，還具有能提供對(duì)細(xì)胞黏附有益 的信號(hào)分子。
[0029] 進(jìn)一步地，步驟S1中還包括原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取，及原代骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，具體為：
[0030] S11、原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲?。?