一種含酸性蛋白酶的啤酒復(fù)合酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶制劑制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種含酸性蛋白酶的啤酒復(fù)合酶及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 啤酒營養(yǎng)豐富，酒精含量低，以其特有的泡沫和特殊的香味，深受廣大消費(fèi)者喜 愛，啤酒中含有人體必須的維生素、氨基酸和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，適量的飲用啤酒有利 于人體健康，故享有"液體面包"的美名。
[0003] 我國啤酒業(yè)發(fā)展迅速，啤酒產(chǎn)量已連續(xù)幾年位居世界首位，但遺憾的是，國產(chǎn)大麥 的發(fā)展卻出現(xiàn)了徘徊不前的窘?jīng)r。其根本原因是受土質(zhì)、氣候、品種、發(fā)芽方法、工藝條件等 的制約，國產(chǎn)麥芽的品質(zhì)一直較低。大的啤酒集團(tuán)不惜高價(jià)進(jìn)口一類澳麥和法麥為啤酒生 產(chǎn)原料，國產(chǎn)大麥由于受諸多因素影響，本身的淀粉酶、蛋白酶、半纖維素酶、磷酸酯酶、氧 化還原酶等在發(fā)芽過程中分泌不足，導(dǎo)致啤酒麥芽中β-葡聚糖、半纖維素、蛋白質(zhì)等含量 過高，造成糖化后麥汁質(zhì)量和產(chǎn)量雙低，不能生產(chǎn)高端啤酒。
[0004] 隨著各種啤酒原料價(jià)格的不斷上漲，特別是進(jìn)口麥芽、大米價(jià)格的直線上揚(yáng)，直接 導(dǎo)致了啤酒生產(chǎn)成本的大幅上升。為維持企業(yè)的生存和發(fā)展，各個(gè)啤酒廠加都在積極應(yīng)對 此項(xiàng)問題，通過技術(shù)創(chuàng)新和提高輔料比例來消化成本上升的壓力，在這種形勢下，原料中添 加小麥芽及淀粉質(zhì)輔料成為啤酒企業(yè)的主要選擇。
[0005] 在大麥芽質(zhì)量較差以及添加淀粉質(zhì)輔料較多的情況時(shí)，酶制劑的添加成為一種必 要。目前，酶制劑市場啤酒復(fù)合酶種類較多，按照添加工序來分有糖化工序、發(fā)酵工序、過濾 工序及灌裝工序啤酒復(fù)合酶，以糖化工序添加的復(fù)合酶較多，其主要的復(fù)配原則是以啤酒 麥芽酶系為基礎(chǔ)進(jìn)行淀粉酶、蛋白酶、半纖維素酶、磷酸酯酶、氧化還原酶等酶制劑的優(yōu)化 組合，成功解決了因?yàn)辂溠抠|(zhì)量差或輔料添加量高而引起的糖化不完全、浸出率低，麥汁粘 度大、過濾困難，蛋白質(zhì)溶解不充分、α -氨基氮含量低等麥汁制造難題。
[0006] 但是，當(dāng)啤酒釀造過程中為了降低生產(chǎn)成本，提高輔料使用比例時(shí)，雖然添加外加 酶制劑糖化可有效改善啤酒口味，降低色度、總酚，延長啤酒保質(zhì)期，但同時(shí)也會產(chǎn)生許多 負(fù)面影響，如氮源不足、過濾困難、非生物穩(wěn)定性降低等，造成釀制出的啤酒氨基酸水平低、 營養(yǎng)價(jià)值不高，啤酒的泡沫性能差、泡沫不豐富，麥芽香味不足等質(zhì)量缺陷，失去了傳統(tǒng)啤 酒的本質(zhì)口感和風(fēng)味，稱不上真正意義的啤酒。為此大多數(shù)啤酒生產(chǎn)廠家通過添加不同的 食品添加劑試圖解決上述質(zhì)量問題但效果仍不理想。中國專利CN103242996 Β公開了一 種啤酒復(fù)合酶及其制備方法，所述啤酒復(fù)合酶以天然濃縮麥芽酶為主要原料，科學(xué)復(fù)配混 合酶，不僅補(bǔ)充了充足的酶源，更重要的是在保護(hù)劑和激活劑協(xié)同作用下，其酶活力更足、 保存性能更優(yōu)越、氮源更豐富、麥芽香味更足，常溫保存2年酶活損失在3%以下；中國專利 CN103865701A公開了一種含中性蛋白酶的啤酒復(fù)合酶及其制備方法，所述啤酒復(fù)合酶中的 中性蛋白酶是由產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌1398-2-12為出發(fā)菌株經(jīng)特定 發(fā)酵條件下的液體深層發(fā)酵而制備的，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力為5500-7000U/mL ;上述 已經(jīng)公開的啤酒復(fù)合酶雖然在啤酒釀造中發(fā)揮了重要的作用，但啤酒復(fù)合酶中蛋白酶的酶 活力有待繼續(xù)提高、蛋白酶酶系不全、啤酒復(fù)合酶組分沒有添加消除自由基并提高酶活力 的抗氧化劑。啤酒復(fù)合酶存在一定的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有啤酒復(fù)合酶中蛋白酶酶活力低、酶系不 全，復(fù)合酶抗氧化能力低、酶活力損失大等缺陷，以濃縮麥芽酶和濃縮麥汁粉為主要原料， 科學(xué)復(fù)配高活力酸性蛋白酶等食品級酶制劑、植物提取物、抗氧化劑、保護(hù)劑、激活劑等；制 得一種蛋白酶系全、酶活力高、不易失活、麥芽香味濃、可為麥汁提供豐富氮源的啤酒復(fù)合 酶。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0009] -種含酸性蛋白酶的啤酒復(fù)合酶，由以下重量份數(shù)的原料組成：
[0010] 濃縮麥芽酶45-55份，淀粉酶30-40份，蛋白酶20-30份，半纖維素酶15-30份，植 物提取物15-20份，濃縮麥汁粉13-18份，酯酶5-10份，保護(hù)劑5-8份，激活劑5-8份，抗氧 化劑1-3份；
[0011] 所述植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、酯酶、氧化還原酶等多種植 物酶；
[0012] 所述植物提取物中還含有植物多糖和單糖、植物淀粉、植物蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，不僅 可為啤酒復(fù)合酶提供全面、豐富的植物酶，還可作為制備酸性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成分，提 高蛋白酶活力和微生物產(chǎn)酶能力；
[0013] 所述植物提取物采用超聲清洗、微波輔助超聲提取和高壓脈沖電場提取、超濾濃 縮等低溫提取技術(shù)，有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率；有效保證了植物提取物的 食品安全性；
[0014] 所述植物提取物的制備方法為：將大麥芽、焦香麥芽按質(zhì)量比2-3:1-2均勻混合， 粉碎至粒度0. 5-lmm，得粉碎麥芽；然后將木瓜、菠蘿、無花果分別于超聲波清洗機(jī)中在功 率200W、頻率30KHz條件下超聲清洗5-10min，浙干，室溫下破碎至粒度0. 5-lmm，并按質(zhì)量 比5-7:4-6:1-3均勻混合，加入混合物質(zhì)量1. 5-3倍的粉碎麥芽得原料混合物，加入原料混 合物1-3倍的水，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3-4,在功率150-300W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微 波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間60-SOs，進(jìn)行間隔式輻照：輻照10s，間隔10s，控制溫度 20-35°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率200-300W，頻率30-40KHZ條件下進(jìn)行超聲波輔助提 取；保溫l_3h，然后，在功率200-400W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波 輻照總時(shí)間90-105S，進(jìn)行間隔式輻照：輻照15s，間隔10s，控制溫度40-60°C，如此輻照10 次，同時(shí)在功率300-500W，頻率40-50KHZ條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，最后自然降溫至室 溫，于電場強(qiáng)度25-35kV/cm，脈沖時(shí)間400-600 μ s，脈沖頻率200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈 沖電場（PEF)提取15-20min ;提取液過濾得第一濾液，加濾渣2倍的水漂洗、過濾得第二濾 液，將第一濾液和第二濾液按質(zhì)量比1:1-2均勻混合，混合液超濾濃縮、冷凍干燥、低溫粉 碎即得植物提取物；
[0015] 優(yōu)選地，所述超聲波清洗機(jī)中清洗液為0. 3-0. 5%的碳酸氫鈉溶液。
[0016] 所述蛋白酶是由以下質(zhì)量百分比組成的酶制劑均勻混合而成：中性蛋白酶50%， 酸性蛋白酶40%，10%脯氨酸蛋白酶；
[0017] 優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶是以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉（Aspergillus usamil)CCTCC NO :M 2013601為出發(fā)菌株，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層發(fā)酵而制得，并且 發(fā)酵培養(yǎng)基中科學(xué)復(fù)配了上述制備的植物提取物；
[0018] 優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶的制備方法包括以下步驟：保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的菌種經(jīng)斜面菌種活化、一級、二級、三級液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)至種子罐，將 種子罐液體種子以5%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度31-321：，攪拌速度200-40(^/ m，通風(fēng)量1:1-2,培養(yǎng)時(shí)間10-12h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至26-30°C，攪拌 速度400-600r/m，通風(fēng)量1:1-3,恒溫培養(yǎng)8-10h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 23-25°C，攪拌速度500-700r/m，通風(fēng)量1:2-4,培養(yǎng)時(shí)間22-31h，然后，將種子罐液體種 子以3%接種量追加接入發(fā)酵罐，最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至31-32°C，攪拌速 度200-400r/m，通風(fēng)量1:1-2,恒溫培養(yǎng)10-12h ;接著以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 23-25°C，攪拌速度500-700r/m，通風(fēng)量1:2-4,恒溫培養(yǎng)22-31h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào) 配、精濾、干燥得固體酸性蛋白酶；
[0019] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物5-10g，干酪素4g， 磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0. 6g，氯化鉀0. 8g，蒸餾水1000mL，pH值5. 8,121°C滅菌20min。
[0020] 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為：麩皮60-80g，玉米粉50-60g，豆餅粉 35-40g，海藻糖10-15g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣5-10g，干酪素5-10g，中草藥提 取物5-10g，硫酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，純凈水1000mL，pH值5-7,121°C滅菌20min ;
[0021] 所述種子罐培養(yǎng)基組成為：麩皮60-80g，玉米粉50-60g，豆餅粉35-40g，海藻糖 10-15g，中草藥提取物10-15g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣5-10g，干酪素5-10g，硫 酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，純凈水1000mL，pH值5-7,121°C滅菌20min ;
[0022] 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7. 0xl0s_8. 0x10s個(gè)/ml ;
[0023] 所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：麩皮60_80g，玉米粉50_60g，植物提取物40_60g，豆 餅粉35-40g，中草藥提取物20-30g，海藻糖10-30g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣 5-10g，干酪素3-5g，硫酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，硝酸鉀l-2g，硫酸鋅0. 1-0. 2g，純凈水 1000mL，pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0024] 所述中草藥提取物的制備方法如下：
[0025] 按重量份數(shù)計(jì)，稱取黃芪60-70份，當(dāng)歸55-65份，黨參40-45份，甘草40-45份， 魚腥草35-45份，神曲35-45份，金銀花25-35份，柴胡10-15份，黃芩10-15份；將上述中 草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度 70°C _90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進(jìn)行 酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5-6. 8,酶解2-4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇 的混合物，乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1:1. 5,控制溫度至60°C -78°C保持3-4h，過濾，得第 一濾液；添加濾渣1-3倍重量的水，控制溫度85°C _95°C保持l_3h，然后降溫至25-35°C，過 濾，得第二濾液；將第一濾液和第二濾液按照質(zhì)量比2-3:1-2合并，濾液真空濃縮后冷凍干 燥、粉碎即得中草藥提取物；
[0026] 所述混合酶為葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻混 合。
[0027] 所述濃縮麥芽酶重量百分比組成為：原麥芽酶60-80%，香味麥芽酶20-40%。
[0028] 所述原麥芽酶制備方法如下：
[0029] (1)高壓脈沖電場（PEF)浸泡處理：將麥芽在預(yù)浸槽中用3-6倍20-50°C溫水浸 泡10-20min，使麥芽水分含量達(dá)到25-35%，同時(shí)進(jìn)行高壓脈沖電場（PEF)處理，電場強(qiáng)度 20-40kV/cm，脈沖時(shí)間 150-200μ s,脈沖頻率 200-300HZ ;
[0030] (2)粉碎：將步驟（1)中處理好的麥芽與浸泡水加入麥芽粉碎機(jī)帶水粉碎，調(diào)整輥 間距為0. 5mm,轉(zhuǎn)速為250rpm,得到麥芽楽液；
[0031] (3)超聲、PEF提?。簩Ⅺ溠繚{液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提 取儀在電流強(qiáng)度〇. 6A/25W-1. 5A/275W條件下進(jìn)行超聲提取10-15min ;然后進(jìn)行高壓脈 沖電場（PEF)提取15-20min，電場強(qiáng)度20-40kV/cm，脈沖時(shí)間400-600μ s，脈沖頻率 200-300ΗΖ ；
[0032] (4)過濾：將提取液于室溫用500-800目濾布預(yù)涂粒度為100目-300目硅藻土， 采用板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，操作壓力為〇. 14