能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法及其引物對(duì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體是涉及一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的 分子標(biāo)記方法及其引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 油汗性狀是羊毛品質(zhì)性狀中的一個(gè)重要指標(biāo)。油汗是皮膚內(nèi)皮脂腺和汗腺的分泌 產(chǎn)物。油汗對(duì)羊毛纖維的品質(zhì)具有很好的保護(hù)作用，特別是綿羊的被毛常年要經(jīng)受日曬、 雨淋、風(fēng)吹、雪刮、尿漬、糞污和大氣的侵蝕，而油汗可保護(hù)羊毛使其化學(xué)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和 各種物理機(jī)械性能免受或少受這些因素的損害。油汗不足的羊毛沒(méi)有正常的光澤，手感發(fā) 硬。羊毛油汗過(guò)多，不僅不需要，而且有害，羊毛不僅增加了不必要的重量，而且產(chǎn)生油汗消 耗了過(guò)多的飼料。雖然羊毛在加工前要把油汗洗掉，但是不能就認(rèn)為油汗是無(wú)用的雜質(zhì)，反 之，在綿羊育種過(guò)程中，必須是羊毛有足夠數(shù)量的良好油汗，因?yàn)樗茄蛎w維必不可少的 保護(hù)物質(zhì)。
[0003] 中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）的培育始于1972年，至今已培育出六個(gè)品系，分別 為車星A型品系、車星B型品系、超細(xì)型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系和U品系。如何 進(jìn)一步改良羊毛油汗程度，培育羊毛油汗適中的種羊，以及快速擴(kuò)大種群規(guī)模仍然是一個(gè) 重要問(wèn)題。
[0004] 核因子I/B (Nuclear Factor I/B，NFIB)是轉(zhuǎn)錄因子NFI家族中的一員，該家族由 NFIA、NFIB、NFIC及NFIX共4個(gè)成員組成。NFIB基因在細(xì)胞增殖、凋亡以及組織發(fā)育中發(fā) 揮著重要作用。目前，有關(guān)NFIB基因的研究主要集中在人和鼠上，NFIB基因在畜禽中的研 究鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)：
[0006] 1、一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法所用引物對(duì)，上引物NFIBF: 如序列表Seq No. 1所示；下引物NFIBR :如序列表Seq No. 2所示。
[0007] 2、一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，包括如下步驟：
[0008] (1)根據(jù)綿羊NFIB基因第5內(nèi)含子區(qū)C82197267T位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物NFIBF和 NFIBR，然后對(duì)綿羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再用內(nèi)切酶Mae II酶切 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；
[0009] (2)使用質(zhì)量濃度為2%~3%的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，然后根據(jù) 電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定；
[0010] (3)根據(jù)中國(guó)美利奴羊試驗(yàn)群體的特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型：Y = μ+G+L+A+G X L+G X Α+Α X L+e，然后利用JMP7. 0統(tǒng)計(jì)軟件將基因型與連續(xù)性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián) 分析，并估計(jì)性狀的最小二乘均值；
[0011] (4)根據(jù)基因型將中國(guó)美利奴羊試驗(yàn)群體分為三種類型，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)示和鑒定綿 羊羊毛油汗的分子標(biāo)記輔助育種，即完成預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法。
[0012] 3、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，所述的步驟
[0013] (l)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下所示：
[0015] ?0?擴(kuò)增條件為：94°(：預(yù)變性51^11;94°(：變性3〇8,53.8°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8， 共36個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10min，4°C終止反應(yīng)。
[0016] 4、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，所述的步驟（1) 獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，序列如Seq No. 3所示。
[0017] 5、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗程度的分子標(biāo)記方法，所述的步驟 (1)酶切體系如下所示：
[0018] 10 XR Buffer 1 μ L
[0019] 內(nèi)切酶 Mae II 1 yL
[0020] PCR 產(chǎn)物 10 μ L
[0021] 酶切條件為：65°C酶切4h。
[0022] 6、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，所述的步驟（2) 基因型的判定的標(biāo)準(zhǔn)如下所示：
[0023] (1)電泳呈現(xiàn)兩條帶，大小為251bp和59bp，則綿羊NFIB基因第5內(nèi)含子區(qū) C82197267T位點(diǎn)未突變時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以被Mae II酶完全切開(kāi)，將其命名為CC基因 型；
[0024] (2)電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為310bp，則綿羊NFIB基因第5內(nèi)含子區(qū)C82197267T 位點(diǎn)突變時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被Mae II酶切，將其命名為TT基因型；
[0025] (3)電泳呈現(xiàn)三條帶，大小為310bp、251bp和59bp，則綿羊NFIB基因第5內(nèi)含子 區(qū)C82197267T位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被Mae II酶完全切開(kāi)，將其命名為CT 基因型。
[0026] 7、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，所述的步驟（3) 構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型，其中，Y為性狀的觀測(cè)值，μ為群體均值，G為基因型效應(yīng)，L為 品系效應(yīng)，Α為年齡效應(yīng)，GXL為基因型和品系的互作效應(yīng)，GXA為基因型和年齡的互作效 應(yīng)，AXL為品系和年齡的互作效應(yīng)，e為剩余值效應(yīng)。
[0027] 8、如2所述的一種能預(yù)示和鑒定綿羊羊毛油汗的分子標(biāo)記方法，所述的步驟（3) 中中國(guó)美利奴羊均為1~12歲的新疆軍墾型母羊。
[0028] 本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因 型對(duì)綿羊羊毛油汗進(jìn)行選擇時(shí)，將使綿羊羊毛的油汗取得很大的遺傳進(jìn)展。羊毛油汗是羊 毛重要的品質(zhì)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀，羊毛油汗不足或者油汗過(guò)多，均對(duì)羊毛的品質(zhì)有重要影響， 羊毛油汗適中，能對(duì)羊毛產(chǎn)生良好的保護(hù)，在生產(chǎn)過(guò)程中也不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的羊毛清洗費(fèi)用， 因此，羊毛油汗適中，對(duì)羊毛價(jià)格有重要的影響。利用本發(fā)明可以對(duì)羊毛油汗進(jìn)行選擇，不 僅為綿羊羊毛的品質(zhì)性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，也為綿羊育種工作中 標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明可以有效的應(yīng)用于 羊毛油汗適中的綿羊的分子輔助育種領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)種羊的早期選種，出生后即可進(jìn)行選留，加 速綿羊的育種進(jìn)程。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為酶切產(chǎn)物的電泳分離圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 中國(guó)美利奴羊基因組DNA的獲得
[0033] 采集綿羊耳組織，_20°C保存?zhèn)溆谩２捎贸Ｒ?guī)的苯酚/氯仿法提取綿羊基因組DNA。 具體方法如下：
[0034] (1)取中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）耳組織5g，剔除結(jié)締組織，將組織塊用70%酒 精清洗、消毒，置于Eppendorf管內(nèi)，用剪刀剪碎，或研磨碎；
[0035] (2)待Eppendorf管內(nèi)的酒精完全揮發(fā)之后，加入分離緩沖液700 μ L，懸浮剪碎的 組織后，加入蛋白酶K(20mg/mL)5. 0 yL，55°C作用8-12h，直到無(wú)組織塊為止；
[0036] ⑶將消化好的組織液取出，加入等量組織液的飽和酸，混勻lOmin，4°C，12000r/ m，離心 lOmin ;
[0037] (4)取上清液，加等量的苯酸/氯仿，輕輕混勾10min，4°C，12000r/m，離心10min ;
[0038] (5)取上清液，加等量的氯仿，混勾10min，4°C，12000r/m，離心10min ;
[0039] (6)取上清液，加2倍量的無(wú)水乙醇沉淀，顛倒混勻后，室溫下靜置10-20min，DNA 沉淀形成白色絮狀物；
[0040] (7)棄去上清，再加70 %的乙醇清洗，棄去上清，在吸水紙上吸取多余液體，自然 風(fēng)干后，加適量的TE溶解，-20 °C保存；
[0041] (8)若DNA溶液中有不溶解顆粒，可在5000r/m短暫離心，取上清；如要去除其中 的RNA，可加入5 μ L RNaseA (10 μ g/ μ L)，37°C保溫30min，用酚抽提后，按步驟4-7重新沉 淀 DNA。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 綿羊NFIB基因酶切產(chǎn)物的獲得
[0044] 根據(jù)綿羊基因組中的NFIB基因 C82197267T位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物NFIBF和NFIBR，然 后對(duì)綿羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再用內(nèi)切酶Mae II酶切PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物。
[0045] 引物序列如下所示：
[0046] NFIBF : 5'-ACAAACAGTTCAAGATTTTTTGC-3 '
[0047] NFIBR :5' -TTTTCACTTCATTATCCC