一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦hpv、mbv和ihhnv的多重pcr檢測(cè)引物、試劑盒及用圖
【專利說(shuō)明】—種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦HPV、MBV和丨HHNV的多重PCR檢測(cè)引物、
試劑盒及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物病原檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)、斑節(jié)對(duì)4下桿狀病毒(Monodon baculovirus, MBV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infect1us hypodermal and hematopoietic necrosisvirus, I HHNV)的多重PCR檢測(cè)引物、試劑盒及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)4下肝胰腺細(xì)小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)屬于細(xì)小病毒科，濃核病毒亞科，平均直徑22-23 nm，有包涵體，單鏈DNA病毒(ssDNA)，無(wú)包膜二十面體。其在病毒學(xué)中屬于慢性感染類型，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高。對(duì)蝦感染肝胰腺細(xì)小病毒后，肝胰腺上皮細(xì)胞腫大，變性，尤其在疾病充分發(fā)展期的病蝦肝胰腺、鰓組織，以及后胃和前中腸粘膜層細(xì)胞壞死解體，最后肝胰腺僅剩下一團(tuán)結(jié)締組織，以至病蝦失去消化吸收功能，呼吸器官也遭到嚴(yán)重?fù)p害，造成窒息而死。
[0003]對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒是已知的導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要細(xì)小病毒之一。HPV已在世界各地的野生對(duì)蝦和養(yǎng)殖對(duì)蝦中被發(fā)現(xiàn)。其致病率高，分布廣，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。HPV很少單獨(dú)感染對(duì)蝦，多與其他多種病原性的病毒發(fā)生混合感染，并且在大多數(shù)情況下，重感染的對(duì)蝦卻沒(méi)有明顯的炎癥反應(yīng)。致病蝦生長(zhǎng)變緩、活動(dòng)呆滯、食欲減退、較少蛻皮，蝦體表常有雜物附著；成蝦甲殼變軟，腹部肌肉變白，常并發(fā)二次性細(xì)菌感染，以弧菌較為常見(jiàn)。迄今為止，還沒(méi)有有效的預(yù)防措施可減少對(duì)蝦的感染。
[0004]斑節(jié)對(duì)4下桿狀病毒(Monodon baculovirus, MBV)又名草?!下桿狀病毒病(grassshrimp baculovirus )、因首次在斑節(jié)對(duì)4下(/fewaeiA?/wwoi/oi?)中發(fā)現(xiàn)而得名。1987-1988年MBV在臺(tái)灣等地區(qū)爆發(fā)流行，1991年在大陸發(fā)現(xiàn)。在中國(guó)、泰國(guó)、新加坡、印度尼西亞、馬來(lái)西亞均有廣泛分布。
[0005]斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬A亞群。病毒為桿狀，有囊膜，有包涵體，為雙鏈DNA病毒(dsDNA)。核衣殼大小為42X246 nm，連囊膜大小約為75X324 nm。不同種類的蝦所觀察到的病毒顆粒大小略有差異。斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒感染部位是肝胰腺及前中腸的上皮細(xì)胞核，并在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)嗜酸性的圓形或橢圓形的病毒包涵體。
[0006]致病蝦食欲減少，活動(dòng)呆滯，鰓、附肢和體表常帶有大量的附生生物。受感染后幼體除部分體色加深外，并無(wú)特別癥狀，多數(shù)攜帶病毒的蝦活動(dòng)正常。受感染幼體群常常無(wú)明顯的癥狀表現(xiàn)而出現(xiàn)大量死亡，更因繼發(fā)感染其它病毒、細(xì)菌或附生物而導(dǎo)致幼體大量死亡。
[0007]傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infect1ushypodermal and hematopoieticnecrosis virus,簡(jiǎn)稱IHHNV)最初于1981年在美國(guó)夏威夷地區(qū)養(yǎng)殖細(xì)角濱對(duì)4下{Litopenaeus stylirostris)中被發(fā)現(xiàn)(Lightner et al，1983)。
[0008]傳染性皮下及造血組織壞死病毒是世界各地養(yǎng)殖和野生對(duì)蝦的重要病原之一，屬于細(xì)小病毒科{ParvoviridaS)短濃核癥病毒屬(Brevidensovirus')。是目前已知的對(duì)4下病毒中顆粒最小的一種，直徑22 nm，單鏈DNA細(xì)小病毒(ssDNA Parvovirus)無(wú)包膜，20面體對(duì)稱的球狀顆粒。IHHNV感染對(duì)蝦的部位，包括外胚層組織，如鰓、表皮、前后腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)索和神經(jīng)節(jié)，以及中胚層器官，如造血組織、觸角腺、性腺、淋巴器官、結(jié)締組織和橫紋肌。在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成包涵體。患此病的病蝦身體變形，引起慢性感染為主。死亡率不高，但嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。
[0009]IHHNV的敏感宿主是細(xì)角濱對(duì)4下(Litopenaeus stylirostris)和凡納濱對(duì)4下{Penaeus ，自然狀態(tài)下可感染大部分養(yǎng)殖對(duì)蝦，引起細(xì)角濱對(duì)蝦的發(fā)病和死亡，在凡納濱對(duì)4下，貝>J表現(xiàn)為慢性矮小殘缺綜合癥(runt-deformity syndrome, RDS)。同時(shí)也是南美白對(duì)蝦常見(jiàn)的一種慢性致病病毒。
[0010]在人工養(yǎng)殖中，對(duì)蝦可同時(shí)感染多種病毒。HPV和MBV在蝦類養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常出現(xiàn)混合感染，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)及海洋資源的可持續(xù)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控就顯得意義非常重大。
[0011]目前，對(duì)蝦病毒病的診斷手段主要包括病理學(xué)和生物學(xué)方法、免疫診斷法，分子雜交及PCR。已建立的常規(guī)PCR技術(shù)，常是一次只能檢測(cè)一種樣本，比較費(fèi)時(shí)間。而多重PCR技術(shù)是一種特殊的PCR方法，在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)病毒特異性引物，能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原體，從而縮短病毒檢測(cè)的周期，提高檢測(cè)效率。但多重PCR檢測(cè)也受多種因素的影響，比如DNA聚合酶的活性、模板的質(zhì)量、所設(shè)計(jì)的病毒引物的特異性、PCR反應(yīng)條件、不同病毒樣本間對(duì)試劑的競(jìng)爭(zhēng)等因素都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的敏感性和準(zhǔn)確性。
[0012]基于當(dāng)前現(xiàn)狀，需建立一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的對(duì)蝦病毒檢測(cè)方法，以利于對(duì)病毒的早期診斷，便于及時(shí)采取有效的防治措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷，檢測(cè)限低，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確率高、且能同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測(cè)方法。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分別為HPV-F 和 HPV-R、MBV-F 和 MBV-R、IHHNV-F 和 IHHNV-R，序列如 SEQ ID N0:1 和 2，SEQ IDNO:3 和 4，SEQ ID NO:5 和 6 所示。
[0015]一方面，本發(fā)明還提供一種用于同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
[0016]另一方面，提供所述多重PCR引物或所述多重PCR檢測(cè)試劑盒中的引物檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的用途。
[0017]另一方面，提供多重PCR引物或所述多重PCR檢測(cè)試劑盒中的引物檢測(cè)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的方法。
[0018]進(jìn)一步，步驟為， 提取DNA，
PCR檢測(cè)，采用權(quán)利要求1的多重PCR引物或權(quán)利要求2的多重PCR檢測(cè)試劑盒中的引物；陽(yáng)性對(duì)照為SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的核酸序列混合作為模板，陰性對(duì)照為:不含有對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒任一病毒的任意DNA核酸序列；
結(jié)果判定，
當(dāng)檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小接近，為90-120bp時(shí)，結(jié)果為對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有90-120bp條帶，則為對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒陰性；
當(dāng)檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小接近，為180-220bp時(shí)，結(jié)果為斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有180-220bp條帶，則為斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒陰性；
當(dāng)檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小接近，為270-320bp時(shí)，結(jié)果為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有270-320bp條帶，則為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陰性；
當(dāng)陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶時(shí)，表明操作過(guò)程中有試劑污染，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照無(wú)條帶時(shí)，表明引物或者試劑盒中相關(guān)試劑降解，引物或試劑盒失效。
[0019]進(jìn)一步，所述PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系為:25 μ L反應(yīng)體系中包含有10倍濃度的含鎂離子的Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.5 μ L，各引物終濃度為0.4μ Μ，提取好待檢測(cè)的DNA模板1 μ L。
[0020]進(jìn)一步，所述PCR檢測(cè)