植物花藥特異表達啟動子pTaASG005的鑒定和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及分離的DNA，其能夠指導(dǎo)可操作地連接在其下游的核酸在植物花藥中特異轉(zhuǎn)錄和/或表達。另外，本發(fā)明還涉及包含該DNA的表達盒和植物等，并涉及該DNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動子是重要的順式作用元件，它是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。根據(jù)其驅(qū)動基因表達的不同特點，啟動子分為組成型啟動子和特異性啟動子。組成型啟動子能在所有細胞或組織中，不分時間和空間地啟動轉(zhuǎn)錄；特異性啟動子又可分為組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子，其中誘導(dǎo)型啟動子平時不啟動轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很低，但在某些特定的逆境信號的刺激下，轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。
[0003]外源DNA序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達，啟動子類型的選擇決定基因的表達時間和部位。目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要是一些組成型的強啟動子，比如CaMV 35S啟動子和玉米Ubiquitin_l啟動子，然而在利用這些啟動子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以期改良作物的品質(zhì)時，往往會由于目的基因表達的時間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動子誘導(dǎo)基因表達量太高而對植物的生長發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強啟動子結(jié)合功能基因來改良作物品質(zhì)時遇到的障礙。
[0004]此外，在研究某些代謝過程或調(diào)節(jié)途徑時，常常需要將同一途徑上的兩個以上的基因轉(zhuǎn)化到同一個株系中去，采用轉(zhuǎn)化其中一個基因得到轉(zhuǎn)基因植株后再轉(zhuǎn)化另外一個基因，或者兩個基因分別轉(zhuǎn)化完成后再進行雜交，都需要等待較長的時間，為了提高效率縮短多個基因轉(zhuǎn)化的時間，最近有報道可以利用新的載體同時進行多個基因的轉(zhuǎn)化，但是在多基因轉(zhuǎn)化時如果重復(fù)使用同一個啟動子，也會由于啟動子序列的高同源性可能導(dǎo)致基因沉默。
[0005]近年來，通過基因工程調(diào)控植物花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系及其恢復(fù)系已在一些作物上獲得成功，為作物雜種優(yōu)勢的利用開創(chuàng)了新的前景。目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動子與外源基因嵌合，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化植物來阻斷花粉發(fā)育的過程從而達到雄性不育的目的。Mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動子TA29與RNase T1或Barnase連接構(gòu)建成嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草和油菜，獲得了穩(wěn)定的雄性不育的轉(zhuǎn)化株(Mariani C等，Induct1n of male sterilityin plants by a chimaeric ribonuclease gene，Nature，1990，347:737-741)。隨后，他們又用TA29驅(qū)動Barstar基因，創(chuàng)建了上述雄性不育系的恢復(fù)系(Mariani C等，A chimaeric ribonuclease-1nhibitor gene restores fertility to male sterileplants, Nature, 1992，357:384-387)。此外，其他研究小組利用花藥特異啟動子啟動反義苯基苯乙烯酮合成酶基因、反義肌動蛋白基因、β_1、3-葡聚糖酶基因等在花藥中特異表達也分別成功地獲得了雄性不育植物(Meer等，Promoter analysis of the chalconesynthase gene of petunia hybrid:a 67bp promoter reg1n directs flower-specificexpress1n, Plant B1l., 1990, 15:95-109 ;李艷紅等，將新的任紅雄性不育基因?qū)胄←溤耘嗥贩N的研究初報，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1999，7:255-258 ； Curt is等，Genomicmale sterility in lettuce, a base line for the product1n of Fihybrid, PlantSc1.， 1996， 113:113-119)。
[0006]植物花粉或花藥啟動子的驅(qū)動活性和特異性決定了通過基因工程手段調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物不育系及恢復(fù)系的成敗。目前已知的驅(qū)動活性高且特異性良好的植物花粉或花藥特異啟動子還相對較少，而小麥因其基因組較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，在花粉或花藥發(fā)育分子機制方面的研究更加匱乏，因此，對小麥花粉特異表達啟動子的克隆和功能分析對于在小麥中利用基因工程調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系，從而為小麥雜種優(yōu)勢資源在小麥育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種植物花粉發(fā)育晚期花藥特異表達的啟動子序列及克隆并應(yīng)用該啟動子的方法。
[0008]取花粉處于減數(shù)分裂期、單核期、雙核期和三核期的小麥花藥，用Trizol (Invitrogen)提取總 RNA，并進行 DNasel (Promega)處理，進而純化 mRNA (Amb1n)。將純化的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄(Invitrogen)、超聲打斷(Fisher)、制備文庫(illumina)并擴增(illumina)，最后在illumina機器上進行測序反應(yīng)。
[0009]小麥轉(zhuǎn)錄組高通量測序的結(jié)果首先通過Trinity軟件進行序列拼接，得到的拼接序列進一步去除冗余以及相似性聚類。對于拼接得到的轉(zhuǎn)錄本contig的表達變化分析，各樣品中高通量測序的序列首先通過TopHat (http://tophat.cbcb.umd.edu/)軟件與轉(zhuǎn)錄本拼接的結(jié)果進行比對。而后Cufflink軟件能夠計算比對上的轉(zhuǎn)錄本contigs的均一化表達量，用“外顯子每百萬比對片段的千堿基數(shù)(fragments per kilobase of exon modelper mill1n mapped fragments，F(xiàn)PKM)，，表不。
[0010]通過對不同發(fā)育時期小麥花藥的全基因組表達譜分析，找到花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達的轉(zhuǎn)錄本contig 7187個。如圖1所示，compl53941_c0_seq4(序列如SEQ ID NO: 1所示)花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達。將cOmpl53941_c0_Seq4所對應(yīng)的基因命名為 TaASG005 (Anther Specific Gene 005) ο
[0011]小麥?zhǔn)怯葾、B、D三套基因組組成的異源六倍體，基因的平均拷貝數(shù)為2.8個，其中接近一半的基因(46%)有3-4個拷貝，12%的基因有1-2個拷貝，42%的基因拷貝數(shù)彡5個。從comp 153941_c0_seq4的序列(如SEQ ID NO: 1所示)出發(fā)，利用CerealsDB和IffGSC(Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu，A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因組供體)的測序信息進行電子克隆，獲得了 3個 TaASG005 基因，分別命名為 TaASG005_l，TaASG005_2 和 TaASG005_3，其中 compl53941_c0_seq4 對應(yīng)于 TaASG005_l。3 個 TaASG005 基因的 cDNA 序列分別如 SEQ ID NO:2，SEQID N0:3和SEQ ID NO:4所示，三者之間的同源性超過95%。分別設(shè)計針對TaASG005_l，TaASG005-2和TaASG005_3cDNA的特異性引物，利用RT-PCR方法，對這三個基因在在小麥根、莖、葉、不同發(fā)育時期的花藥及除花藥以外的其他花器官等多種組織材料中進行表達特異性分析，結(jié)果如圖2所示，TaASG005-l、TaASG005-2和TaASG005_3基因均只在花粉處于單核期和雙核期的花藥中特異性表達，在同時期的其他花器官和根、莖、葉及減數(shù)分裂期的穗子、三核期的花藥及其他花器官等組織器官中都不表達，說明TaASG005-l、TaASG005_2和TaASG005-3基因是花藥特異表達、且只在花粉發(fā)育晚期的花藥中特異表達的基因。
[0012]本發(fā)明還提供了三個花藥特異表達的啟動子，所述啟動子通過以下方法獲得:從 TaASG005-l、TaASG005_2 和 TaASG005_3 基因的 cDNA 序列出發(fā)，利用 CerealsDB 和IffGSC(Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu，A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因組供體)的測序信息進行電子克隆，獲得了 TaASG005-l、TaASG005_2 和 TaASG005_3 基因的啟動子，分別命名為 TaASG005_l 啟動子、TaASG005-2啟動子和TaASG005_3啟動子，在本發(fā)明中所述啟動子也可分別稱為pTaASG005-l、pTaASG005-2 和 pTaASG005_3，其長度分別為 2032bp、2047bp 和 2009bp，序列分別如 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示。
[0013]利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫和PLACE數(shù)據(jù)庫，對TaASG005_l啟動子、TaASG005_2啟動子和TaASG005-3啟動子進行順式元件分析。如圖3所示，翻譯起始位點ATG用粗體下劃線表示，以翻譯起始位點ATG的A定義為“+1”，AGAAA基序用陰影表示，GTGA基序用方框表示。TaASG005-l啟動子中有6個AGAAA基序、4個GTGA基序，TaASG005_2啟動子中有5個AGAAA基序、6個GTGA基序，TaAS