以沙門(mén)氏菌菌毛為載體的hiv-4e10表位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種以沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛agfA為 載體、含有外源基因 HIV-4E10的重組沙門(mén)氏菌，以及以該重組沙門(mén)氏菌為有效成分的表位 疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] HIV-1感染機(jī)體后能夠刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此學(xué)術(shù)界普遍 認(rèn)為，有效預(yù)防HIV-1感染的疫苗必須同時(shí)具備誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性的體液免疫和細(xì) 胞免疫的雙重能力。而事實(shí)上，雖然HIV疫苗的研究由來(lái)已久，但隨著研究的深入，人們發(fā) 現(xiàn)要研制具備上述特性的理想疫苗還面臨著許多困難：其中最關(guān)鍵的問(wèn)題是HIV病毒變異 性高。HIV基因變異速度快，在病毒感染過(guò)程中抗體中和表位和CTL表位的變異使病毒快速 逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，導(dǎo)致疫苗的效力降低，所以如何在快速變異的病毒分子中篩選 出能夠誘導(dǎo)廣泛中和抗體的保守性抗原是開(kāi)發(fā)艾滋病疫苗的關(guān)鍵。為解決這個(gè)問(wèn)題，近年 來(lái)以保守的包膜主要中和表位（principle neutralizingdeterminants，PND)為基礎(chǔ)的表 位疫苗應(yīng)運(yùn)而生。研究結(jié)果表明，表位多肽疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)不同HIV-1毒株的 廣譜中和抗體，是一種很有前途的疫苗形式。由于大多中和表位僅由幾個(gè)或幾十個(gè)氨基酸 組成，免疫原性較差，因此如何提高表位的免疫原性并能誘導(dǎo)能夠中和多個(gè)HIV-1分離株 抗體反應(yīng)的表位疫苗是目前研究的重點(diǎn)。
[0003] HIV-1保守的廣譜中和表位主要集中在跨膜蛋白gp41的近膜端胞外區(qū)（MPER)， MPER主要含有3個(gè)構(gòu)象依賴(lài)性抗原決定簇（aa579-604, aa619-648, aa644-663)，含有2F5、 4E10和Z13三個(gè)具有廣譜中和活性的抗原表位。雖然從病人體內(nèi)分離出的抗體可以中和高 度多樣化的HIV-1分離株，但研究表明以這3個(gè)表位研制的疫苗卻很難誘生出具有廣譜中 和活性的中和抗體（BNabs)反應(yīng)。4E10是目前中和作用最廣泛的HIV單克隆抗體。其抗原 核心表位被證實(shí)為NWFDIT基序，但利用抗原表位氨基酸未能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的4E10的中和 抗體。以往MPER抗體的脂質(zhì)結(jié)合性和自身反應(yīng)性是其顯著特征，也是疫苗誘導(dǎo)此類(lèi)抗體的 重要阻礙，但4E10表位可能是HIV表位疫苗不可或缺的表位之一。所以對(duì)于4E10表位疫 苗而言可能不僅需要天然4E10表位的呈遞，還需要運(yùn)用一個(gè)載體平臺(tái)，使其具有足夠的免 疫原性去引導(dǎo)4E10樣抗體進(jìn)化。
[0004] 由于粘膜是HIV感染的主要途徑之一，因此粘膜免疫是預(yù)防HIV性傳播的重要手 段。對(duì)于HIV表位疫苗來(lái)說(shuō)，人們期望構(gòu)建一種疫苗載體既能提高表位的免疫原性并能通 過(guò)粘膜途徑有效地將HIV抗原表位遞呈給機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生局部粘膜的IgA和 CTLs的反應(yīng)，以及全身的特異性CTLs及IgG、IgM的反應(yīng)。減毒沙門(mén)菌就是這樣一個(gè)理想 的高效遞呈外源抗原的粘膜載體的候選者，這是因?yàn)樯抽T(mén)菌是具有高度侵襲性的細(xì)胞內(nèi)寄 生菌，在感染人體后不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的局部粘膜免疫反應(yīng)，而且由于其細(xì)胞內(nèi) 寄生的特性，沙門(mén)菌能誘導(dǎo)機(jī)體形成較廣泛的全身免疫反應(yīng)，包括血清抗體、粘膜IgA抗體 以及不同類(lèi)型的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。攜帶外源抗原的沙門(mén)菌可直接接觸腸道局部粘膜，并 由此侵入腸粘膜上皮細(xì)胞。開(kāi)始，沙門(mén)菌可滯留在內(nèi)噬小體內(nèi)，但其質(zhì)粒所攜帶的抗原可經(jīng) 細(xì)胞凋亡機(jī)制釋放出來(lái)，被抗原提呈細(xì)胞加工后，傳遞給免疫活性細(xì)胞，從而誘導(dǎo)體液及細(xì) 胞免疫反應(yīng)一一這是迄今沙門(mén)菌用作疫苗載體在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫的一般過(guò)程，其中很多情況 下沙門(mén)菌是用來(lái)攜帶載有抗原表位的質(zhì)粒載體。然而在使用質(zhì)粒載體的過(guò)程中存在著一個(gè) 明顯問(wèn)題，即表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，這是因?yàn)橹亟M質(zhì)粒往往帶有抗生素耐藥基因，在 人體內(nèi)缺乏抗生素壓力的情況下，質(zhì)粒易丟失。也有研究者把抗原表位基因整合到染色體 上，然而外源基因的表達(dá)通常水平低下，難以產(chǎn)生足夠的重組蛋白以激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。 有研究表明將甲1型流感病毒HA上的抗原肽和NP上的抗原肽與沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白融合表 達(dá)，經(jīng)鼻免疫BALB/C小鼠后能夠抵御不同亞型流感病毒（H1NUH2N2和H3N2)的攻擊。但 由于鞭毛是細(xì)菌的動(dòng)力器官而且數(shù)量較少，如何提高攜帶外源蛋白的數(shù)量以增強(qiáng)攜帶蛋白 的免疫原性是沙門(mén)菌疫苗載體急需解決的問(wèn)題。
[0005] 沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛（Thin aggregative fimbriae)和細(xì)菌的抗原性及黏附性有 關(guān)，直徑3-4nm，為周身菌毛（500根/細(xì)胞），其單體蛋白（fimbrin)攜帶的外源表位拷貝 數(shù)可達(dá)500, 000/細(xì)胞，適宜作為活疫苗。該細(xì)聚合菌毛結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于5M Na0H、8M尿素 或2%十二烷基磺酸鈉（SDS)，其單體蛋白僅在90%甲酸溶液中發(fā)生解聚。AgfA蛋白是細(xì) 聚合菌毛的一種主要的單體蛋白，在沙門(mén)菌中結(jié)構(gòu)保守。該蛋白抗原性強(qiáng)，對(duì)于檢測(cè)插入其 中的外源表位是十分重要。
[0006] 沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛agfA具有以下特點(diǎn)：1)高水平表達(dá)并且位于細(xì)菌的表面。沙 門(mén)氏菌的細(xì)聚合菌毛是細(xì)菌表面毛發(fā)狀蛋白附屬物，一般不參與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)而有可能與細(xì) 菌的黏附有關(guān)。細(xì)聚合菌毛的表達(dá)量非常高，每個(gè)細(xì)菌大約有100~1000條，每條細(xì)聚合 菌毛至少由1000個(gè)相同的菌毛亞單位呈螺旋狀排列聚合而成。因此如果以細(xì)聚合菌毛為 載體表達(dá)外源多肽則其表達(dá)量將非常強(qiáng)大。2)很大的容納性。外源片段的置換幾乎不影響 agfA自身的表達(dá)3)可起到佐劑的作用。以此為載體表達(dá)的表位將能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生 強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶外源蛋白HIV-4E10數(shù)量多的重組沙門(mén)氏菌，以 及提供該沙門(mén)氏菌在制備HIV-4E10表位疫苗中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明首先提供一種重組質(zhì)粒，其為PHSG-4E10,通過(guò)以下方法構(gòu)建得到：
[0009] (1)兩步重疊 PCR法構(gòu)建嵌合基因 agfA: :4E10 ;
[0010] (2)將嵌合基因 agfA: :4E10片段與溫度敏感性質(zhì)粒HSG415通過(guò)酶切連接得到。
[0011] 其中，步驟（1)所述的兩步重疊 PCR方法為：
[0012] 1)第一輪 PCR 擴(kuò)增：分別以 agfAfor 和 4E10rev，4E10for 和 agfArev 為引物，以 沙門(mén)氏菌基因組為模板PCR擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段A和B ;
[0013] 所述agfAfor引物序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0014] 所述agfArev引物序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0015] 所述4E10for引物序列如SEQ ID NO. 3所示；
[0016] 所述4E10rev引物序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0017] 2)第二輪PCR擴(kuò)增：以A和B為模板，agfAfor和agfArev為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得 到含有外源基因4E10的嵌合agfA片段agfA: :4E10。
[0018] 本發(fā)明提供了上述重組質(zhì)粒在制備預(yù)防或治療HIV引起的疾病藥物中的應(yīng)用。優(yōu) 選地，所述的藥物為疫苗。
[0019] 本發(fā)明提供了沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛agfA的A6氨基酸在制備重組沙門(mén)氏菌中的用 途，發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將此區(qū)域替換掉后不影響該菌毛的生物學(xué)活性。
[0020] 本發(fā)明提供了沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛agfA的A6氨基酸在制備以agfA為載體的外 源基因表達(dá)載體中的應(yīng)用，是將外源基因置換沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌毛agfA的A6氨基酸的序 列 STIELTQNGFRNNATT。
[0021] 本發(fā)明提供了一株重組沙門(mén)氏菌ST-4E10,是將HIV-14E10中和表位置換減毒沙 門(mén)氏菌的細(xì)聚合菌毛agfA的A6氨基酸；所述HIV-14E10基因的氨基酸序列為NWFDIT。
[0022] 本發(fā)明的重組沙門(mén)氏菌ST-4E10,通過(guò)以下方法制備得到：
[0023] (1)將重組質(zhì)粒pHSG-4E10電穿孔轉(zhuǎn)入沙門(mén)氏菌ST14028-3b中；
[0024] (2)同源重組：挑取單個(gè)已確定含有重組質(zhì)粒pHSG-4E10的菌落接種至含100 μ g/ ml Amp的TB培養(yǎng)基，42 °C，搖床振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；取上述菌液再次接種上述培養(yǎng)基中，繼續(xù)擴(kuò) 大培養(yǎng)；取菌液劃線于含100 μ g/ml Amp的LB平板上，42°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取4-8個(gè)陽(yáng)性菌 落，接種于新鮮TB培養(yǎng)基中，28°C，搖床振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，該步驟充分2-3次后，菌液稀釋6-8 倍，分別取10 6、10 7、10 8菌液均勻涂布于LB平板，28°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取同一個(gè)單菌落，劃線 于不含抗生素的LB平板和含氨芐青霉素100 μ g/ml的LB平板，28°C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選氨芐青 霉素敏感的菌落；
[0025] (3)從氨芐青霉素敏感的菌落中利用PCR方法篩選含外源基因 4E10的重組沙門(mén) 氏菌ST-4E10 ;PCR所用的引物為agfAfor和agfArev，其核苷酸序列分別如SEQ ID Ν(λ 1-2 所示。
[0026] 本發(fā)明還提供了重組沙門(mén)氏菌ST-4E10在制備治療或預(yù)防HIV感染引起的疾病藥 物中的用途。
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的重組沙門(mén)氏菌ST-4E10可作為疫苗載體用于 制備HIV-4E10表位疫苗。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防HIV感染引起的疾病的藥物，其含有重 組沙門(mén)氏菌ST-4E10。
[0029] 優(yōu)選地，所述藥物為生物制品。更優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于，成功將HIV-14E10抗原表位置換至沙門(mén)氏菌細(xì)聚合菌 毛agfA中，構(gòu)建了能夠表達(dá)HIV-14E10抗原表位的載體，即沙門(mén)氏菌重組菌ST-4E10。序 列分析表明，該沙門(mén)氏菌重組菌ST-4E10在菌毛基因上含有外源基因4E10,且不含有質(zhì)粒 Phsg415的復(fù)制子序列，western blot結(jié)果顯示菌毛蛋白表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ST-4E10 的LD5。為1 X 10 ^CFU，其感染小鼠后在小鼠各臟器中均有明顯分布，能廣泛刺激機(jī)體的免 疫系統(tǒng)并引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)HIV-14E10表位的中和抗體和特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)